WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 12 |

waltl мы наблюдали миграцию клеток с периферии вовнутрь, в полость сформированных ИС сфероидов, и митозы. Отдельные митотические фигуры были отмечены и в ядерных слоях ИС. Пролиферация клеток ИС приводила к образованию пула нейробластов, способных к дальнейшим делениям, миграции и замещению погибших нейронов. Дополнительно проведенные иммуноцитохимические исследования позволяют отнести пролиферирующие клетки ИС тритона как к прогениторным клеткам ростовой зоны, так и клеткам макро- и микроглии. При культивировании ИС взрослой крысы, на фоне транслокации фоторецепторных клеток вовнутрь и их гибели, имела место пролиферация (BrdU метка и митозы) в наружной и внутренней областях ИС. Источником этих клеток, однако, не была как у тритона периферия сетчатки. Делящимися были макрофаги сетчатки, а также глиальные клетки, локализованные среди нейронов внутреннего ядерного слоя. При культивировании заднего сектора глаза без сетчатки ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) тритона и крысы демонстрировал как сходства, так и отличия. При проведении сравнительного анализа морфологии, пролиферации и экспрессии клетками маркерных специфических белков выяснено, что клетки РПЭ обоих видов животных способны при вымещении приобретать макрофагальный фенотип, а оставаясь в слое экспрессировать пан-нейральные маркеры. Однако только РПЭ тритона, но не крысы был способен к образованию в ряде случаев зачатка сетчатки, состоящего из 1 – 2-х рядов пролиферирующих и дедиференцирующихся клеток. Разработанный нами впервые подход оказался хорошим инструментом для изучения поведения и сравнения клеток источников регенерации сетчатки у взрослых низших и высших позвоночных.

Направленная биоостеоиндукция мезенхимальных клеток костного мозга Попандопуло А.Г., Оберемко А.В., Оксимец В.М.

ГУ «Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака АМНУ» Костная ткань является производной мезенхимы и относится к обновляющейся ткани (Гололобов В. Г., 2003), дифферонная организация которой представлена от стволовых до высокодифференцированых клеток.

Предшественниками остеогенных элементов, как при физиологической, 46 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи так и при репаративной регенерации являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые при определенных условиях обладают способностью дифференцироваться по остеобластическому типу (Aнохина Е. Б., 2007).

Культуру МСК получали из костного мозга, дополнительно осуществляли эксплантацию участка малоберцовой кости с надкостницей, первичное выделение из биоптата прогениторных клеток надкостницы (ПКН) с последующим культивированием. Микс-культуру получали путём совместного культивирования ПКН и МСК в соотношении 1:3. Экспериментальные исследования проводились с четырьмя группами клеточных линий:

1) контоль, МСК, культивируемые в стандартной среде; 2) МСК, культивируемые в разработанной нами среде; 3) микс-культура, стандартная среда; 4) микс-культура, разработанная нами среда. Также были проведены исследования, в которых разработанная нами среда добавлялась в микскультуру после образования плотного монослоя (через 7 суток). Поверхность плазматических мембран предварительно помечалась прижизненными красителями РКН67 Green (для МСК) и PKH26 Red (для ПКН). В течение четырёх недель каждые 7 дней производили окраску на щелочную фосфатазу.

Данные наблюдений позволяют предположить, что ПКН: 1) in vitro в микс-культуре играют роль инициаторов начала процесса остеогенеза, определяя пространственное расположение МСК, характерное для культуры ПКН; 2) создают определённое микроокружение за счёт синтеза специфических веществ, являющихся продуктами их жизнедеятельности.

В результате получаем не просто однородную культуру остеогенных клеток, как при химической индукции, например, дексаметазоном, но культуру клеток, дающую начало формированию in vitro костной ткани. В микс-культуре клетки сохраняют способность к пролиферации, что также является преимуществом такого метода направленной дифференцировки.

Управление нейральной дифференцировкой трансплантируемого клеточного материала Павлова Г.В., Ревищин А.В.

Учреждение Российской Академии Наук Институт биологии гена РАН Развитие клеточных технологий дает новые пути решения проблем лечения дегенеративных заболеваний. Показана интенсификация регенера47 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи тивных процессов при системных и локальных введениях клеток костного мозга. Эти результаты позволяют надеяться на применение в клеточной терапии аутологичных клеток костного мозга или жировой ткани, что снимает проблему тканесовместимости и многие этические проблемы. В нашей лаборатории под руководством Леонида Ивановича Корочкина были начаты разработки методов подготовки и применения клеточного материала для аутологичной трансплантации животным с экспериментальной нейродегенерацией. Мы занимаемся поиском методов и факторов, обеспечивающих управление пролиферацией и дифференцировкой этих клеток в культуре, и после их трансплантации в мозг.

Методы включают ко-культивирование с клетками, содержащими индуцирующие факторы, добавление индуцирующих факторов в среду, воздействие трансгенного материала на дифференцировку прогениторных клеток.

Была показана возможность применения кондиционных сред для дифференцировки стволовых клеток мезенхимального происхождения в сторону инсулин продуцирующих и нервных клеток. Кондиционированная среда была получена посредством культивирования клеток соответствующих органов животных в обычной культуральной среде. Например, для направления дифференцировки в сторону дофаминэргических нейронов применялась среда культивирования клеток черной субстанции мозга новорожденного поросенка.



Один из возможных путей усилить приживляемость и дифференцировку пересаженных клеток состоит в воздействии на ткани нейротрофических факторов, таких как GDNF, BDNF. Особый интерес представляет использование стволовых клеток, как носителей GDNF и BDNF для управления нейральной дифференцировкой не только трансплантируемых клеток, но и клеток предшественников в тканях пациента.

Конструкции, полученные на базе вектора EGFP-N 1 и содержащие гены белков GDNF, BDNF и GFP, былb введенs в эмбриональные клетки линии НЕК-293. Эксперименты по трансплантации трансгенных и контрольных клеток в мозг подопытных мышей показали, что экспрессия трансгенов подавляет реактивный глиоз, вызванный травмой при введении клеток, а также экспериментальной локальной ишемией после введения эндотелина.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ, Миннауки, Минобразования 48 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи -катенин, 130 и E2F4 формируют функциональный комплекс в мезенхимальных стволовых клетках Петров Н.С.,1 Жидкова О.В.,1 Сериков В.Б.,2 Попов Б.В.Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава Возможность широкого использования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в регенеративной терапии основана на эффективном управлении их дифференцировочным потенциалом, в формировании которого важную роль играет сигнальный путь Wnt / -катенин. При культивировании МСК мыши в среде с ионами лития или их кокультивировании с легочными эпителиальными клетками линии А-549 в условиях разделения клеточнонепроницаемой мембраной в МСК повышается уровень -катенина, происходит его активация, увеличивается количество и накапливаются активные формы белка р130 (члена семейства продукта гена ретинобластомы) и транскрипционного фактора E2f4, индуцируется экспрессия легочных эпителиальных маркеров. р130 формирует комплекс с Gsk3 и -катенином, который обнаруживается как в интактных, так и в стимулированных ионами лития клетках. Образование комплекса р130-Gsk3--катенин подтверждается путем коиммунопреципитации р130 и -катенина антителами к Gsk3, а р130 — антителами к -катенину. Рисунок фосфорилирования p130, физически взаимодействующего с Gsk3 и -катенином при формировании комплекса, отличается от такового в общем клеточном экстракте.

Эти данные предполагают функциональную роль комплекса р130-Gsk3-катенин в регуляции дифференцировки МСК.

Работа поддержана грантом 09 – 04 – 00595 РФФИ и государственным контрактом 02.512.11.2253.

49 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Разработка методик дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани человека в миогенном и хондрогенном направлениях Пономарева А.С.1, Сургученко В.А.2, Севастьянов В.И.Московский физико-технический институт (государственный университет) ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И.Шумакова» Минздравсоцразвития Получение преддиференцированных или дифференцированных культур клеток — одна из ключевых задач при использовании стволовых клеток (СК) в регенеративной медицине. Перспективным источником СК является жировая ткань.

Цель работы заключалась в разработке методик дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из жировой ткани человека в миогенном и хондрогенном направлениях в условиях in vitro.

Источником стволовых клеток служили образцы подкожно-жировой клетчатки человека. Получение культуры МСК включало в себя сочетание механической и ферментативной дезагрегации. Индукцию миогенной дифференцировки МСК осуществляли на 2 пассаже, средой содержащей DMEM, 10 % ЭТС, 5 % ЛС, дексаметазон, гидрокортизон, антибиотик / антимикотик. Контроль дифференцировки клеток проводили еженедельно на протяжении 6 недель с помощью антител Anti-human MyoD1, Anti-Myogenin и Anti-human Smooth Muscle Myosin Heavy Chain (Dako, Дания).

Для индукции дифференцировки МСК в хондрогенном направлении использовали набор STEMPRO® Chondrogenesis Differentiation Kit (Invitrogen, США). Суспензию МСК во 2-м пассаже концентрацией 16106 кл / мл рассевали по 10 мкл в лунку 24-х луночной планшеты. После 2-х недель инкубации получали культуру клеток в виде микроагрегатов, хондрогенную природу подтверждали с использованием красителя Alcian Blue (Sigma, США).

Доказана эффективность разработанных методик для получения преддифференцированных клеток в миогенном и хондрогенном направлениях.

50 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Получение инсулин-продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток (МСК) пупочного канатика человека Спирова И.А.1,2, Ржанинова А.А. 1,2, Гольдштейн Д.В. 1, Медико-генетический научный центр РАМН, Москва ЗАО «РеМеТэкс», Москва Одним из наиболее перспективных способов лечения сахарного диабета 1-го типа (СД1) является получение инсулин-продуцирующих клеток из альтернативных источников.

Из пупочного канатика (ПК) были изолированы и пассированы МСК, которые характеризовались фенотипом CD29+, CD44+, CD49a+, CD73+, CD90+, CD45-, CD31-. МСК трансфицировали рекомбинантным аденовирусом со встроенным ключевым геном панкреатической дифференцировки Pdx1. Сорбцию аденовируса проводили 2, 6, или 24 часа. В качестве контроля использовали нетрансфицированные клетки. Далее клетки культивировали в течение 3х дней, после чего из них выделяли мРНК и синтезировали кДНК. Наилучшее время адсорбции аденовируса определяли по уровню транскрипции гена Pdx1 с помощью метода ПЦР в реальном времени.





Уровень мРНК выравнивали по отношению к двум генам домашнего хозяйства GAPDH и -Actin. Относительное количество мРНК рассчитывали с помощью С (Т) метода.

Было обнаружено, что трансфекция Pdx1 в МСК приводит к активации транскрипции генов, участвующих в пути дифференцировки стволовых клеток в -клетки: NeuroD, NGN3, MafA и транскрипции гена инсулина на высоком уровне. В контроле транскрипция этих генов не наблюдалась.

Впервые продемонстрирована направленная дифференцировка МСК ПК в инсулин-продуцирующие клетки путем введения гена фактора транскрипции Pdx1, что позволяет предположить возможность их перспективного использования в клеточной терапии СД 1.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09 – 04 – 00724-а.

51 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Регенерация костей черепа после трансплантации тканеинженерной конструкции на основе аутологичных мультипотентных стромальных клеток, преддифференцированных в остеогенном направлении Волков А.В.1,2, Шустров С.А.1,2, Алексеева И.С.3, Арутюнян И.В.1,4, Ржанинова А.А.1,4, Большакова Г.Б.2, Гольдштейн Д.В.1, ЗАО «РеМеТэкс», Москва НИИ морфологии человека РАМН, Москва ФГУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Росмедтехнологий, Москва Медико-генетический научный центр РАМН, Москва В настоящее время в клинической практике широко распространены методы направленной регенерации костной ткани, в которых используются имплантационные материалы, обладающие остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами. В экспериментальном исследовании изучали сравнительную эффективность направленной регенерации костной ткани гранул медицинского гидроксиапатита («BioOss»), деминерализованного костного матрикса («Биоматрикс»), частично деминерализованного костного матрикса («Остеоматрикс») и тканеинженерной конструкции на основе аутологичных мультипотентных стромальных клеток, преддифференцированных в остеогенном направлении (по протоколу RMosteo-AT ЗАО «РеМеТэкс»). У кроликов массой 4 кг формировали полнослойные костные дефекты теменных костей до твердой мозговой оболочки, на поверхность которой помещали исследуемый материал с обогащенной тромбоцитами плазмой крови. Животных выводили из эксперимента на 120 сутки эксперимента. Образцы подвергали обычной гистологической проводке.

Гистологические срезы окрашивали гематоксилином-эозином.

Показано, что применяемые в клинической практике коммерческие остеопластические материалы не приводят к полноценной регенерации костей черепа, основной вклад в регенеративный процесс вносит материнская кость. При трансплантации тканеинженерной конструкции вся область костного дефекта была заполнена костной тканью, что демонстрирует более высокую эффективность данной биомедицинской технологии.

52 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Исследование туморогенного потенциала культур мультипотентных стромальных клеток (МСК) и коммитированных хондробластов человека на лабораторных моделях Nude/Balb и SCID Ржанинова А.А.1,2, Мурашов А.Н.3, Новикова Н.И. 3, Кириенко Е.Е. 1,2, Гольдштейн Д.В.1, ЗАО «РеМеТэкс», Москва Медико-генетический научный центр РАМН, Москва Институт биооргпнической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (Филиал), г. Пущино МО Туморогенный потенциал клеточной культуры, используемой для трансплантации человеку, является важнейшей характеристикой, определяющей безопасность ее клинического применения. Выбор экспериментальной модели и линии позитивного контроля — основные параметры, определяющие чувствительность и достоверность методики тестирования туморогенности.

Исследовали 2 культуры МСК из костного мозга, 3 культуры стромальных клеток из жировой ткани и 5 культур хондробластов, выделенных из участка фиброзного кольца краевой пластинки межпозвоночного диска. В качестве положительного контроля была выбрана постоянная линия клеток злокачественной мезенхимальной опухоли человека A-204, которая не образует в организме иммунодефицитных животных опухолевых масс крупных объемов и обладает низкой метастатической активностью. Результаты исследования показали, что при подкожном введении 107 клеток мышам Nude / Balb через 15 дней трансплантаты опытных культур в месте введения не обнаруживались, клетки позитивного контроля также полностью элиминировались. Введение культур в аналогичных условиях мышам линии SCID CB-17 выявило прогрессивный рост мезенхимальных опухолей в группе позитивного контроля (10 / 10), в опытных группах отмечали медленную регрессию трансплантатов, образование фиброзной капсулы и дифференцировку клеток. Таким образом, показано, что тестирование туморогенной безопасности культур мезенхимального происхождения целесообразно проводить на лабораторной модели мышей линии SCID, так как при использовании мышей Nude высока опасность получения ложноотрицательного результата.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям (госконтракт № 02.512.11.от 04.07.2008).

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 12 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.