WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 12 |

После внутривенной трансплантации меченые МСК находились непосредственно в мозговой ткани, граничащей с дефектом. В самом месте тканевого повреждения быстрее протекали процессы воспаления и образования рубцовой ткани. В пограничной области количество микрососудов и жизнеспособных нейронов было больше, чем в контроле в 1.6 и 1.7 раза соответственно. Следовательно, внутривенная трансплантация МСК привела к уменьшению площади вторичной дегенерации нервной ткани в неокортексе. Через 2 нед после травмы в области проводящих путей глубокой части хвостатого ядра у животных контрольной группы были обнаружены пролиферирующие клетки, а в группе клеточной терапии нет. Через 1 нед после травмы были выявлены только единичные пролиферирующие клетки в хвостатом ядре в обеих группах. Мы можем предположить, что пролиферирующие клетки – это астроциты (но иммуногистохимически это не 38 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи доказано). Пролиферация астроцитов свидетельствует о гибели аксонов.

Если наше предположение верно, то отсутствие пролиферирующих клеток в проводящих путях говорит о сохранении их целостности.

Итак, внутривенная трансплантация МСК способствует сохранению микроциркуляции и жизнеспособности нейронов в пограничной с повреждением зоне, уменьшению объема ткани мозга, затронутой процессами вторичной дегенерации, что позволяет минимизировать количество дегенерирующих волокон в экстрапирамидных проводящих путях, тем самым сохраняет моторику животных.

Улучшение васкуляризации мышечной ткани после аутотрансплантации стволовых клеток периферической крови больным облитерирующим эндартериитом Мавликеев М., Табанакова А., Трондин А., Певнев Г., Бурганова Г., Киясов А.

Казанский государственный медицинский университет Облитерирующий эндартериит (ОЭ) — хроническое заболевание сосудов нижних конечностей, характеризующееся прогрессирующей ишемией тканей и приводящее к инвалидизации больных. Традиционные методы лечения обеспечивают лишь временное улучшение течения болезни, что диктует необходимость поиска новых методов лечения ОЭ. Одним из них может стать клеточная терапия стволовыми клетками (СК), эффективность которой показана в доклинических исследованиях. Нами проведены клинические исследования в рамках программы «Развитие клеточной медицины в Республике Татарстан». Целью нашей работы стало изучение влияния трансплатации СК на плотность капиллярной сети мышечной ткани у больных ОЭ.

Исследования проведены на биоптатах икроножной мышцы пораженной конечности 30 больных ОЭ до и через 3 месяца после внутримышечного введения аутологичных СК, мобилизованных G-CSF. Для выявления капилляров парафиновые срезы окрашивали иммуногистохимически с антителами к маркерам эндотелия — CD31, CD34 и фактору фон Виллебрандта (vWF). Далее производили подсчет числа мышечных волокон и капилляров и определяли их соотношение.

Результаты. CD31 и vWF присутствовали только в эндотелии сосудов, тогда как экспрессия CD34 была хорошо выражена как в эндотелии сосу39 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи дов, так и капилляров, что позволяет сделать вывод о целесообразности использования именно этого маркера для изучения капилляров скелетной мышцы человека. Проведенный морфометрический анализ позволил установить, что однократное введение аутологичных СК приводит к возрастанию плотности капиллярной сети в пораженных мышцах в среднем на 33,25 % (p <0,05). Таким образом, аутотрансплантация СК периферической крови приводит к улучшению васкуляризации ишемизированной конечности путем стимуляции развития микроциркуляторного русла, что происходит, по-видимому, за счет дифференцировки трансплантированных СК в эндотелиоциты.

Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека Медведев С.П. 1, Григорьева Е.В.1, Малахова А.А.1, Шевченко А.И.1, Савушкина Д.А.2, Бернвальд В.В.2, Соболев И.А.2, Закиян С.М.Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) получены из эмбриональных фибробластов кожи плода человека (9-я неделя беременности) методом ретровирусной трансдукции генетических конструкций экспрессирующих кДНК генов Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4 мыши. Для повышения эффективности получения клонов ИПСК, был применен ингибитор гистондеацетилаз — 2-пропилвалериановая кислота (valproic acid), в концентрации 0,5 µM. В результате трансдукции 1 млн. фибробластов наблюдали появление 500 первичных колоний, по фенотипу сходных с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК) человека. При дальнейшем культивировании 200 колоний получены 18 стабильных линий ИПСК человека, четыре из которых (iPS-A24, iPS-A29, iPS-21L и iPS-30L) были детально проанализированы. Данные клоны имеют морфологию ЭСК человека, экспрессируют щелочную фосфатазу, эндогенные белки OCT4 и NANOG, а также поверхностные антигены TRA-1 – 60 и TRA-1 – 81. В результате ОТ-ПЦР анализа транскрипции 24 генов (OCT4, NANOG, DPPA2, DNMT3, hTERT и др.), являющихся маркерами ЭСК человека, обнаружено, что полученные ИПСК имеют идентичный с ЭСК человека паттерн экспрессии генов. Кариотипический анализ полученных линий ИПСК показал, что они имеют нормальный набор хромосом — 46, XY.

40 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Таким образом, было показано, что экспрессия генов Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4 мыши в клетках человека, способна вызывать репрограммирование и образование стабильных клонов ИПСК по своим характеристикам аналогичных ЭСК человека. Использование низкомолекулярных химических соединений, таких как 2-пропилвалериановая кислота, существенно повышает выход первичных ЭСК-подобных колоний.



Аутологичные нейральные прогениторные клетки на основе пигментрованных клеток глаза человека Милюшина Л.А, Александрова М.А.

Институт биологии развития им Н.К, Кольцова РАН, лаб. проблем регенерации и экспериментальной нейробиологии Клетки пигментного эпителия (ПЭ) глаза человека наряду с клетками пигментированного эпителия цилиарного тела и клетками Мюллеровской глии сетчатки были отнесены к стволовым / прогениторным клеткам глаза.

Целью нашей работы являлось исследование мультипотентных свойств клеток ПЭ глаза плодов человека 9– 11.5 недель развития (нр) и глаза взрослого человека, их способности к трансдифференцировке в нейрональном направлении in vitro при разных условиях культивирования. Полученные культуры анализировали с применением широкого спектра антител.

Установлено, что ПЭ глаза человека, как на 9 – 11.5 нр, так и во взрослом глазу, представляет собой гетерогенную популяцию клеток, в которой присутствуют три подтипа, отличающиеся по адгезивным свойствам, миграции, способностям к трансдифференцировке и ответам на факторы микроокружения. Первая субпопуляция клеток устойчиво сохраняют эпителиальные свойства. В этих клетках иммуноцитохимически выявлялись белки межклеточных контактов Cx43 и N-Cadherin. Клетки второго подтипа изменяют исходный морфотип, становятся фибробластоподобными. Эти клетки демонстрируют положительную окраску на маркеры нейральной дифференцировки: нестин, III-тубулин и GFAP, и на маркеры фоторецепторных клеток рековерин. Третья субпопуляция представлена клетками способными образовывать свободноплавающие сферы. Иммуноцитохимический анализ показал, что сферы были сформированы Pax6 и нестин- позитивными клетками, и при стимуляции дифференцировки эти клетки демонстрируют активную мультипотентную дифференцировку в нейральном направлении.

41 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Данная работа подтвердила и уточнила данные о влиянии факторов FGF и EGF на пролиферацию, миграцию и на трансдифференцировку клеток ПЭ глаза человека. Однако нами впервые была показана гетерогенность клеток ПЭ, поведение которых in vitro различны, что позволяет в зависимости от поставленных целей работать с той или иной субпопуляцией клеток ПЭ.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 08 – 04 – 00081) и по контракту с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.512.12.2008.

Кардиомиопатия мышей mdx как модель для изучения терапии миокарда при помощи трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга Михайлов В. М., 2Мамаева Г. И., 1Соколова А. В., 1Зенин В.В., Фирсанов Ю.В., 1Веженкова И.В.

1 Институт цитологии РАН, Больница №31, Санкт-Петербург Кардиомиопатия мышей mdx является примером патологии миокарда, обусловленная мутацией белка дистрофина. Плейотропный эффект мутации включает в себя нарушение экспрессии более 1700 генов (Turk et al., 2005). По нашим данным удельная плотность митохондрий у кардиомиоцитов мышей mdx (0.274 ± 0.016) достоверно меньше чем таковая у кардиомиоцитов мышей С57Bl / 6 (0.329 ± 0.018). Концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx ниже на 20 % чем в миокарде мышей С57BL / 6, что указывает на гипертрофическую форму кардиомиопатии. Для мышей mdx также характерен такой признак начальной стадии апоптоза как наличие в экстракте миокарда фрагментов ДНК размером 64 – 65 т. п. н. Таким образом, кардиомиоциты мышей mdx постоянно находятся в начальной стадии апоптоза, избегая вступления в деструктивную стадию (Михайлов и др., 1998, 2001, 2003, 2007). Термодинамический стресс (ТДС; плаванье при +120 С) повреждает кардиомиоциты как мышей mdx так и мышей C57BL / 6, вызывая появление в экстрактах миокарда низкомолекулярных фрагментов ДНК через 1 ч после ТДС. При этом ядра 40 % кардиомиоцитов мышей mdx реагировали с антисывороткой к фосфорилированной форме гистона Н2Ах, маркера двунитевых разрывов ДНК. Суточная потеря кардиомиоцитов мышей mdx после ТДС была около 3 %. Через 1 – 24 ч после ТДС в миокарде мышей mdx зарегистрировано достоверное накоп42 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи ление Sca-1 позитивных клеток (Sca-1+ клетки). Представляет интерес установление участия Sca-1+ клеток в регенерации миокарда после ТДС.

Мононуклеарные клетки, обогащенные на 27 % Sca-1+ клетками, были выделены из костного мозга мышей C57Bl / 6 магнитным способом и введены внутривенно 9 мышам mdx возраста 1 год в дозе (0.7 – 1.0) х 106, у которых предварительно были сделаны персональные электрокардиограммы (ЭКГ). Согласно нашим начальным исследованиям характерным признаком ЭКГ мышей mdx является отрицательная реполяризация пика Т, свидетельствующая о повреждении миокарда. Внутривенное введение Sca-1+ клеток уже через 12 – 13 сут восстанавливало нормальную позицию пика Т. Эффект сохранялся через 1.5 и 2 месяцев. Представляет интерес анализ участия трансплантированных стволовых клеток костного мозга в регенерации и стабилизации функции миокарда при кардиомиопатии.

Гранты РФФИ 05 – 04 – 46609 и 06 – 04 – 08338офи.ю.

Проникновение антисмысловых олигонуклеотидов в стромальные клетки жировой ткани мыши Молчанова Е.С.1, Семенова М.Л.1, Кошелева Н.В.1,2, Молчанов А.Ю.1, Сергеев С.А.Биологический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН Стромальные клетки, полученные из жировой ткани (СКЖТ), по спектру экспрессии, пролиферативному потенциалу и способностям к дифференцировке в различные производные практически не отличаются от МСК и являются перспективными кандидатами для аутологических трансплантаций (Трактуев и др., 2006; Nakagami et al., 2006; Zuk et al., 2001). Одними из претендентов на роль ген-направленных агентов, влияющих на дифференцировочные процессы стволовых клеток, в том числе СКЖТ, являются антисмысловые олигонуклеотиды (АсОДН), способные образовывать прочные специфические комплексы с внутриклеточными мРНК и ингибировать процесс трансляции целевых белков. Имеются противоречивые сведения об эффективности и механизмах проникновения АсОДН в различные типы клеток (Daniel et al., 2005, O’Rear et al., 2005, Тимченко и др., 2006, Zheng et al., 2007). Целью нашей работы стало изучение проникновения АсОДН в СКЖТ мыши. Исследовали проникновение олигонуклеотидов в первичную культуру СКЖТ, полученную из подкожной жировой ткани мы43 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи шей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)1Osb/J, использовали два меченых флуорохромом TAMRA АсОДН к мРНК eGFP: АсОДН-А, формирующие вторичную структуру «шпилька», и АсОДН-Б, не имеющие вторичной структуры. АсОДН-Б практически не проникали в СКЖТ. Тогда как структурированные АсОДН-А хорошо проникали в СКЖТ и локализовались в цитоплазме, преимущественно в околоядерной области, в районе Аппарата Гольджи. Полученные различия в проникновении структурированных и неструктурированных АсОДН и данные о локализации АсОДН в клетках, позволяют предполагать, что олигонуклеотиды проникают в СКЖТ посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Таким образом, наличие вторичной структуры, «шпильки», влияет на проникновение АсОДН в СКЖТ, что может быть учтено при разработке методов направленной дифференцировки этих клеток с использованием АсОДН.





Работа поддержана грантом компании Сarl Zeiss, Германия №2-13.

Применение культивируемых стромальных (мезенхимальных) клеток костного мозга в регенеративной медицине Николаенко Н.С.1, Цупкина Н.В.1, Деев Р.В.2, Матюков А.А.3, Кухарева Л.В.1, Бармашева А.В.3, Вилкова Ю.В.1, Сахенберг Е.И.4, Александрова С.А.1, Старикова Э.В.1, Шатрова А.Н.1, Зенин В.В.1, Пинаев Г.П. Институт цитологии РАН; 2Военно-Медицинская Академия им. С.М.Кирова; 3Санкт-Петербургский медицинский университет им. акад.И.П.Павлова; 4Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, Санкт-Петербург В отделе клеточных культур института цитологии РАН (Санкт-Петербург) совместно с соисполнителями из других учреждений в течение нескольких лет ведется разработка технологии создания тканеинженерных эквивалентов с использованием мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) костного мозга крысы, кролика и человека. Нами были оптимизированы условия выделения этих клеток, была исследована их мультипотентность. Было показано, что клетки способны к терминальной дифференцировке в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях. Были разработаны экспериментальные модельные раны (в черепе и других костных тканях кролика) и показано влияние трансплантируемых в коллагене ММСК на репаративный остеогистогенез в области дефекта теменных костей.

44 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи С целью поиска наилучшего носителя для трансплантации ММСК в костную ткань были исследованы коллагены, выделенные различными методами из шкуры овцы, быка и из хвостов крысы. Было установлено, что способность к миграции и остеогенной дифференцировке максимальны у клеток в коллагене из шкуры овцы. Кроме того, для трансплантации ММСК в область дефекта большеберцовой кости был использован деминерализованный костный матрикс. На его основе был создан тканеинженерный эквивалент кости, обеспечивающий полноценное совмещение преддиференцированных в условиях культивирования in vitro клеток и трехмерного материала-носителя.

Были начаты разработки тканеинженерных эквивалентов хрящевой ткани и ткани десны на основании индуцированных к дифференцировке ММСК и фибробластов кожи в коллагеновом геле.

Была показана способность ММСК к дифференцировке в кардиомиогенном направлении in vitro и ангиогенном направлении in vivo (при трансплантации клеток в ишимизированную сердечную мышцу). Было показано влияние эндотелиальных клеток на иммунофенотип и дифференцировку ММСК.

На основании полученных данных сделан вывод о перспективности создания тканеинженерных эквивалентов костной и других тканей на основе культивируемых ММСК в коллагеновом геле и в других носителях и применении таких эквивалентов в регенеративной медицине.

Метод органотипического культивирования тканей глаза позвоночных животных как способ для изучения клеточных источников для регенерации сетчатки Новикова Ю.П., Алейникова К.С., Поплинская В.А., Григорян Э.Н.

Институт биологии развития РАН Для активации регенерационных потенций тканей глаза взрослых позвоночных за счет увеличения пролиферации и изменения фенотипа клеток мы использовали новый подход — органное ротационное культивирование in vitro изолированной сетчатки и заднего сектора глаза без сетчатки. Выбранный метод in vitro позволяет сохранять клеточное микроокружение, осуществлять долговременное культивирование, а также направленно манипулировать компонентами среды. Для сравнения пролиферативных возможностей клеток источников регенерации использованы два объекта 45 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи — взрослые тритон и крыса, т. е. животные с высоким и низким потенциалом к регенерации. При культивировании ИС взрослого тритона Pl.

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 12 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.