WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 12 |

Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Мезенхимные стромальные клетки (МСК) рассматриваются как мультипотентные тканеспецифические стволовые и родоначальные клетки взрослого организма, способные осуществлять направленную дифференцировку в различные клетки соединительной ткани. Сравнительный анализ экспрессии позитивных и негативных маркеров МСК из зрелого костного мозга (КМ) и печени зародышей (ПЗ) на разных сроках их культивирования проведен с использованием методов иммуноцитохимии, проточной цитофлуориметрии и ПЦР-анализа. Иммунофлюоресцентный анализ первичных культур из КМ и ПЗ выявил примесь CD45+ и CD34+ клеток. С помощью ПЦР-анализа во всех исследованных культурах МСК на 1 – 2 пассаже детектирована мРНК генов CD45, CD11b и CD144. Все это указывает на присутствие в составе изучаемых популяций макрофагов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток на ранних этапах культивирования. Однако, начиная с 3-го пассажа, обе популяции МСК освобождаются от примесей кроветворных и эндотелиальных клеток. Кроме того, в обеих культурах на 1-ом и последующих пассажах не обнаружена мРНК гена маркера В-лимфоцитов CD19. На 1 – 3 пассажах практически все МСК из КМ экспрессировали маркеры CD90 и CD73. По предварительным данным цитофлуори31 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи метрического анализа CD90 выявлен в 89.1 и 92.1 % клеток популяции из ПЗ, тогда как CD73 — лишь в 59.5 и 68.3 % этих клеток. На 8 – 11-ом пассажах подавляющее число МСК из КМ и ПЗ экспрессировали CD90, что согласуется с данными ПЦР-анализа, тогда как эспрессия CD73 в обеих культурах МСК названных пассажей сохранялась лишь в отдельных клетках — 8.2 % в культуре МСК из КМ и 3.8 % в культуре МСК из ПЗ по данным цитофлуориметрии. При долгосрочном культивировании МСК из КМ и ПЗ также наблюдалось заметное снижение содержания мРНК гена CD73. Нами выявлено снижение уровня экспрессии еще одного гена — CD105 в обеих клеточных популяциях МСК. Цитофлуориметрический анализ различных субпопуляций МСК будет продолжен.

Получение и идентификация постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека Кольцова А.М., Крылова Т.А., Яковлева Т.К., Мусорина А.С., Полянская Г.Г.

Институт цитологии РАН Эмбриональные стволовые клетки человека, выделенные из эмбрионов не позднее стадии бластоцисты, представляют собой уникальный клеточный материал, обладающий такими свойствами как неограниченная пролиферация и способность дифференцироваться в производные трех зародышевых листков и в линию половых клеток. Эти свойства делают их перспективным объектом для фундаментальных и прикладных биомедицинских исследований.

Несмотря на уникальность каждой линии ЭСК, что определяется её геномом, все они должны отвечать определенному набору характеристик, подтверждающих их статус. В настоящей работе представлены результаты по получению двух постоянных линий ЭСК и подтверждению их статуса как ЭСК человека. Выделение внутриклеточной массы из предимплантационных бластоцист проводили механическим методом. Последующее культивирование выделенных ЭСК проводили на слое фидерных клеток (митотически инактивированные эмбриональные мезенхимные фибробласты человека). Пересев ЭСК проводили механическим способом путем нарезания колоний на отдельные кластеры.

Обе линии ЭСК прошли более 120 удвоений клеточной популяции.

Среднее время одного удвоения клеточной популяции для этих линий составило 28.2+0.6ч и 21±0.6ч соответственно. Обе линии имеют нормаль32 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи ный кариотип человека 46, ХХ.

С помощью гистохимического анализа показана высокая активность щелочной фосфатазы. Иммунофлуоресцентный анализ выявил экспрессию транскрипционных факторов Oct-4 и Nanog, поверхностных антигенов SSEA-4 и TRA-1 – 60, а также экспрессию маркеров, характерных для производных эктодермы, мезодермы и эндодермы в условиях in vitro.

В обеих линиях выявлена экспрессия Р-гликопротеина, АТФ-связывающего ABCG2 транспортера, являющегося, по-видимому, одним из механизмов защиты ЭСК от повреждений, вызываемых проникновением в клетку активных агентов.

Эффект фракционирования дозы облучения ослаблен у стволовых кроветворных клеток мышей, радиорезистентность которых повышена путем предварительного введения животным канцерогена 1,2-диметилгидразина Конопляников А.Г., Коноплянникова О.А., Проскуряков С.Я., Кальсина С.Ш., Агаева Е.В., Носаченко В.В.

Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск В опытах на мышах линии CBA методом фракционирования дозы облучения изучали в сравнительном плане способность к восстановлению сублетальных радиационных повреждений в КОЕ-С-8 у интактных мышей и у животных, которым за сутки до облучения инъецировали канцероген — 1,2-диметилгидразин. Были подтверждены ранее полученные нами данные о том, что введение мышам канцерогена за 1 сутки до гамма-облучения в дозе 7 Гр приводит к повышению радиорезистентности КОЕ-С-8, тестируемую методом селезеночных эндоколоний. При фракционированном облучении мышей в той же суммарной дозе (последовательно 4 и 3 Гр, разделенные временным интервалом в 4 ч) у мышей, не получавших канцероген наблюдается значительное повышение выхода селезеночных эндоколоний, а у животных с введением канцерогена такой эффект выражен значительно слабее. Можно предположить, что введение данного канцерогена, вероятный эффект которого связывается с повреждением активности гена p53 и торможением апоптоза в облученных клеток с нарушениями генетического материала, приводящем к повышению их радиорезистентности, одновременно нарушает механизм репарации сублетальных радиационных повреждений.



33 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Использованную нами экспериментальную модель можно рассматривать как способ изучения свойств предшественников, так называемых, раковых стволовых клеток (РСК), материалы по характеристике которых достаточно скудны. Ранее было установлено, что РСК обладают повышенной резистентностью к химио- и лучевой терапии. Данные этого исследования свидетельствуют о возможном нарушении протекания в РСК репаративных процессов после нанесения радиационных повреждений, что может быть использовано при разработке новых схем лучевой терапии радиорезистентных форм злокачественных опухолей.

Экспериментальное обоснование и клинический опыт клеточной терапии методом системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток при язвенном колите и болезни Крона Конопляников А.Г., Князев О.В., Лазебник Л.Б., Цыб А.Ф.

Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск Центральный НИИ гастроэнтерологии, Москва Известно, что уникальные иммунологические свойства мезенхимальных стволовых клеток (МСК), связанные с их способностью ослаблять иммунные конфликты в организме, побуждают рассматривать их как один из наиболее перспективных агентов при лечении различных аутоиммунных заболеваний (Le Blanc K., Ringden O., 2005). В настоящее время в ряде зарубежных стран и в России начались клинические исследования по использованию МСК при лечении больных язвенным колитом и болезнью Крона, так как существующие методы терапии пока остаются мало эффективными. В коллективной работе двух наших институтов вначале были проведены предклинические исследования по оценке терапевтического эффекта внутривенной (системной) трансплантации МСК на модели острого и хронического колита, вызванного у крыс линии Вистар добавлением в питьевую воду декстран-сульфата. Было показано, что введение подопытным крысам с индуцированным острым и хроническим колитом размноженных в культуре костномозговых МСК в дозе 5 млн клеток/кг массы тела обладает выраженным лечебным действием. Основываясь на полученных данных, а также на данных литературных, был разработан клинический протокол терапии больных язвенным колитом и болезнью Крона путем системной трансплантацией аллогенных костномозговых МСК, который сходен с раз34 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи решенным FDA в США протоколом 2 – 3 стадий клинических испытаний.

В проводившемся нами исследовании применяли культуры МСК, выращиваемые согласно лицензии Росздравнадзора МЗиСР РФ ФС-2006/ 206.

У всех 30 пациентов наблюдали резкое ослабление воспалительного процесса, нормализацию иммунного статуса, что позволило отменить у большинства использование кортикостероидов. У наблюдаемых более года пациентов не было выявлено каких-либо побочных и нежелательных эффектов трансплантации МСК.

Лечебный эффект мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и кондиционной среды из под культур МСК при радиационых и радиационно-термических повреждениях Конопляников А.Г., Проскуряков С.Я., Петров В.Н., Коноплянникова О.А., Ульянова Л.И., Лепехина Л.А., Кальсина С.Ш., Семенкова И.В., Агаева Е.В., Носаченко В.В.

Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск В опытах на лабораторных животных (мышы и крысы различных линий) было изучено терапевтическое действие аутологичных, аллогенных и ксеногенных МСК и кондиционной среды из под культур МСК при различных формах лучевого и радиационно-термического поражения. Внутрибрюшинное введение лабораторным животным МСК или кондиционной среды незадолго до общего гамма-облучения или сразу после него ослабляло летальный эффект и поражение региональных стволовых клеток, тестируемые при «костномозговой» и «кишечной» формах лучевого поражения.

Подобное терапевтическое действие введения МСК или кондиционной среды регистрировали также в случае нанесения мышам комбинированной термо-лучевой травмы. Так как практически не было выявлено существенных видовых различий при введении облученным животным клеток и кондиционной среды аутологичного, аллогенного и ксеногенного происхождения, то можно предположить, что наблюдаемый эффект в основном определяется за счет паракриннного действия агентов, продуцируемых в процессе роста культур МСК. Идентификация и выделение этих агентов и создание на этой основе новых радиозащитных и лечебных препаратов поэтому становится одной из актуальных задач радиационной биологии и регенеративной медицины.

35 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Влияние различных методов трансплантации мезенхимных стволовых клеток костного мозга на посттравматические процессы в головном мозге крыс Григорян А.С.1, Гилерович Е.Г. 2, Павличенко Н.Н.1, Кругляков П.В.1, Соколова И.Б.1, Полынцев Д.Г. ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург Изучение морфологических изменений в головном мозге после механического повреждения — необходимый этап исследования возможностей клеточной терапии в коррекции последствий черепно-мозговой травмы.

Эксперименты проведены на крысах инбредной линии Вистар-Киото. Мезенхимные стволовые клетки (МСК) были выделены из костного мозга животных, культивированы и окрашены флуоресцентным красителем PKHin vitro. Травма была нанесена в левое полушарие головного мозга. МСК трансплантировали на 3 сут после операции непосредственно в нервную ткань, окружающую травматическую полость (группа 1), в хвостовую вену (группа 2), и сочетанно (группа 3). Животным из групп контроля не проводили терапии, либо вместо МСК инъецировали чистую культуральную среду MEM-alpha. Образцы нервной ткани отбирали через 7 сут после нанесения травмы. Анализ распределения МСК в мозге показал, что при внутривенной трансплантации меченые клетки располагаются непосредственно в области травмы, при инъекции в паренхиму мозга они обнаруживаются также в желудочковой системе. По результатам гистологического анализа можно заключить, что наибольшее повреждение нервной ткани, характеризующееся массовой гибелью нейронов и глиозом, обнаруживается в группе 1, меньшее — в группе 3, и наименьшее из всех групп — в группе 2. В группах 2 и 3 патологический процесс выражен сильнее, чем в группах контроля, при этом в мозге наблюдаются несвойственные ему образования, состоящие в том числе из трансплантированных клеток, вызывающих локальный фиброз. Судя по клеточному составу инфильтрата, образующегося в травматической полости и прилежащих к ней участках, МСК ускоряют процесс посттравматического асептического воспаления.





Предварительно можно заключить, что трансплантация МСК при травме головного мозга — перспективный метод клеточной терапии, однако положительный эффект оказывает только внутривенная трансплантация.

36 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Эффективность применения мезенхимальных стволовых клеток в терапии сахарного диабета I типа у крыс Вийде С. К., Соколова И. Б., Кругляков П. В., Полынцев Д. Г.

ООО “Транс – Технологии” Санкт - Петербург По числу заболевших сахарный диабет занимает одно из ведущих мест в экономически развитых странах. К настоящему моменту эффективность применяемых методов лечения недостаточна: полного выздоровления добиться не удается. А между тем количество пациентов с каждым годом увеличивается, и заболевают все более молодые люди Цель исследования: проверить, можно ли с помощью внутривенной трансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) скорректировать состояния диабетических животных и предотвратить развития осложнений.

Эксперименты проводятся на крысах – самцах линии Вистар – Киото. МСК были выделены из костного мозга животных. Фенотипирование МСК проводили методом проточной цитофлуориметрии.

Сахарный диабет был смоделирован посредством интраперитониальных инъекций стрептозотоцина (2 укола через 3 сут по 30 мг/кг). Животным из группы клеточной терапии через 7 сут после 1 укола внутривенно было введено 5 млн МСК в 100 мкл культуральной среды. Длительность эксперимента – 155 сут.

Результаты. Через 155 сут в группе клеточной терапии количество животных было в 1, 6 раза больше, чем в контроле. При этом у всех животных сохранялся высокий уровень глюкозы в крови.

На гистологических препаратах поджелудочной железы при окраске по методу Гейденгайна было показано, что введение МСК предотвращает развитие фиброза островков Лангерганса.

Через 155 сут у животных контрольной группы были выявлены абсцессы в ткани почек (42,8 %), печени (28,6 %), легких (14,3 %), тогда как в группе клеточной терапии только у 10 % животных отметили морфологические изменения в ткани почки.

Итак, однократным внутривенным введением МСК крысам, больным сахарным диабетом I типа, не удалось скорректировать уровень глюкозы в крови животных и предотвратить развитие гипергликемии. Однако, клеточная терапия позволила увеличить продолжительность жизни и практически полностью предотвратить развитие диабетических осложнений.

37 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Влияние внутривенной трансплантации мезенхимальных стволовых клеток на посттравматические процессы в головном мозге крыс Соколова И. Б., Федотова О. Р., Гилерович Е. Г., Павличенко Н. Н., Кругляков П. В., Полынцев Д. Г.

ООО “Транс – Технологии” Санкт - Петербург Эффективность применения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) при инсультах и травмах головного мозга показана во многих экспериментальных работах. Цель данного исследования – выяснить, какие морфологические изменения в ткани головного мозга после клеточной терапии приводят к восстановлению поведения животных с минимальной травмой (1 мм3) первичной двигательной коры.

Эксперименты проведены на нелинейных половозрелых крысах – самках (n=100) массой 250 – 300 г. МСК были выделены из костного мозга животных и перед трансплантацией помечены флуоресцентным красителем РКН 26. Фенотипирование МСК проводили методом проточной цитофлуориметрии. Поведение животных в тесте «Открытое поле» изучали за несколько дней до нанесения мозговой травмы и через 2, 4 нед. Эвтаназия животных была проведена через 1, 2 и 4 нед после травмы. Сегмент мозга с зоной повреждения от 8 животных фиксировали в формалине, от 3 – криофиксировали. Проведено иммуногистохимическое окрашивание препаратов на PCNA, NeuN, vWF.

Через 4 нед после травмирования контрольные животные двигались примерно в 2 р меньше, чем интактные, тогда после введения МСК крысы полностью восстановили свое поведение.

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 12 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.