WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |

Спонтанное изменение фенотипа и кариотипа мезенхимных стволовых клеток человека в культуре Григорян А.С.1, Кругляков П.В.1, Таминкина Ю.А.1, Пендина А.А.2, Полынцев Д.Г.ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург ГУ НИИ Акушерства и Гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург Сегодня трансплантация мезенхимных стволовых клеток (МСК), выделенных из костного мозга человека, считается перспективным терапевтическим подходом к лечению ряда заболеваний. Тем не менее, до сих пор остается актуальным вопрос о возможности спонтанного изменения свойств данных клеток при их культивировании in vitro и даже о приобретении ими туморогенного потенциала. В нашей работе было обнаружено, что даже при непродолжительном культивировании в общепринятых стандартных условиях единичные культуры МСК человека подвержены изменению характеристик. Этот феномен встречается примерно в одной из двухсот культур МСК, полученных из костного мозга здоровых доноров. На втором-третьем пассажах морфология клеток меняется: они резко увеличиваются в размерах, становятся более отростчатыми, в ядрах четко выявляется одно-два крупных ядрышка. Часть клеток, напротив, округляется, открепляется от культурального пластика и переходит в суспензию, где продолжает активно делиться. Анализ иммунофенотипа клеточной популяции показывает, что с каждым пассажем снижается экспрессия клетками основного маркера МСК – CD90. На первых пассажах доля клеток, экспрессирующих CD90, составляет от 98 до 100%, на четвертом-шестом – около 80%, к десятому пересеву культуры в ней остается не более 10-15% клеток, экспрессирующих CD90. При анализе кариотипа данных клеток было обнаружено, что от 5 до 23% клеток в культуре несут множественные хромосомные абберации: как числовые (полиплоидии, наличие дополнительных маркерных хромосом), так и структурные (транслокации, делеции и инсерции). Пов24 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи торяемости геномных перестроек не выявлено, что говорит о том, что каждая перестройка происходит в отдельной клетке. К настоящему времени не выяснен вопрос о том, являются ли такие клетки туморогенными, однако мы считаем, что данные случаи должны обратить более пристальное внимание исследователей на проблему контроля свойств мезенхимных стволовых клеток в культурах для исключения негативных побочных эффектов их обратного введения в организм человека в терапевтических целях.

Влияние культивирования в бессывороточной среде на морфофункциональные свойства лМСК Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б.

Учреждение Российской академии наук Государственный научный центр Российской Федерации – Институт медико-биологических проблем РАН Мезенхимальные стромальные клетки-предшественники из липоаспирата (лМСК), представляют собой малодифференцированные клетки с высокой пролиферативной активностью, которые при аллогенном введении в организм не провоцируют иммунный ответ. Однако, для предварительной экспансии лМСК in vitro используют эмбриональную сыворотку коров (FBS), компоненты которой при попадании в организм могут вызывать развитие иммунной реакции. Альтернативой использованию FBS в настоящее время является применение бессывороточных сред. Целью настоящего исследования было изучение морфофункциональных свойств лМСК при культивировании в бессывороточной среде MSCBM (Lonza, USA).

лМСК культивировали в стандартной среде (DMEM) с 10 % FBS и в среде MSCBM в течение 3 пассажей, рассчитывали количество клеточных удвоений (КУ), фенотипировали и определяли жизнеспособность.

Состояние лизосом и митохондрий оценивали, окрашивая клетки лизо- и митотрекерами, соответственно.

Показано, что при культивировании в среде MSCBM лМСК были более крупными и распластанными, с выраженой зернистостью в перинуклеарной области. Между лМСК, культивируемыми в DMEM+10 % FBS и в среде MSCBM не обнаружено различий в количестве КУ, жизнеспособности (93 %+3 %) и иммунофенотипом. При культивировании лМСК в DMEM+10 % FBS, был выше трансмембранный потенциал митохондрий, чем в Lonza. Более интенсивное окрашивание лМСК лизотрекером 25 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи в Lonza указывало на закисление лизосомального компартмента клетки, что свидетельствовало об активации лизосом.

Таким образом, обнаружено, что при использовании среды MSCBM ухудшается морфофункциональное состояние лМСК, что диктует необходимость дальнейших поисков альтернативы культивирования клеток с сывороткой.

Работа выполнена при финансовой поддержке контракта № 02.522.11.2006 Роснауки.

Инактивация Х-хромосомы в линиях эмбриональных стволовых клеток человека Зайцева Н.С.

Институт цитологии и генетики СО РАН, Центр клинической экспериментальной медицины СО РАМН Основное свойство эмбриональных стволовых клеток – плюрипотентность, поддерживается за счет экспрессии определенных генов, предотвращающих дифференцировку. В мышиных стволовых клетках с кариотипом ХХ, одним из показателей плюрипотентности, а следовательно недифференцированного состояния, является наличие двух активных Х-хромосом, тогда как для эмбриональных стволовых клеток человека данные противоречивы.

В работе использованы три линии ЭСК человека, с кариотипом ХХ (HUES9, ESM01, ESM04). Проведено исследование экспрессии основных генов, ответственных за плюрипотентное состояние клеток, направления дифференцировки исследуемых клеточных линий и статус Х-хромосом.



Показано, что все три линии клеток являются плюрипотентными и обнаруживают высокий уровень экспрессии генов OCT4, NANOG, SOX2, DNMT3B, TDGF1. Отмечено, что экспрессия гена GDF3 снижена в линии ESM04.

Экспрессия гена XIST, ключевого для процесса инактивации Х-хромосомы, обнаружена в линиях ESM01 ESM04, тогда как в линии HUES9 ген XIST не экспрессируется. Для уточнения статуса Х-хромосом в клеточных линиях проведено исследование модификаций хроматина:Н3К4me2, являющейся маркером транскрипционно активного хроматина, а также Н3К27me3 и белка НР1 – маркеров транскрипционно неактивного хроматина. Показано, что в линии ESM04 выявляется неактивная Х-хромо26 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи сома, на которой отсутствует гистоновая модификация Н3К4me2. В линиях ESM01 и HUES9 данная модификация обнаружена на всех хромосомах, что свидетельствует об отсутствии неактивной Х-хромосомы. В линии ESM04, на одной из двух Х-хромосом выявлено не только отсутствие Н3К4me2, но и обогащение Н3К27me3 и НР1. Таким образом, исследованные линии отличаются статусом Х-хромосом и могут находиться на разных стадиях процесса инактивации. Очевидно, что наличие инактивированной Х-хромосомы в ЭСК человека не связано с их плюрипотентным состоянием и носит линиеспецифичный характер.

Разработка технологии лечения нейротрофических язв при сахарном диабете Макеев О.Г., Улыбин А.И., Зубанов П.С., Зверева А.С., Васильева М.С.

ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия Росздрава».

Отдел молекулярных медицинских технологий ЦНИЛ. Кафедра биологии В процессе проведения клинического этапа испытаний по применению аутогенных фибробластов для закрытия язвенных дефектов у 9 больных сахарным диабетом второго типа проанализирована полугодовая эффективность применения клеточной терапии.

Отбор пациентов проводился на основании анамнестических данных, результатов врачебного осмотра, лабораторных исследований и добровольного информированного согласия испытуемого. Критерием включения в испытание являлось наличие язвенного дефекта в течение не менее 6 месяцев, безуспешность консервативного лечения и площадь язвы не менее 35х10 мм (на стопе) и 65х50 мм (на голени).

Технология включала в себя взятие эксплантата кожи, культивирование полученных клеток в среде ДМЕМ с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки и факторов роста. Суспензию, содержащую до 5 млн. клеток однократно наносили на область язвенного дефекта и фиксировали аутологичной фибриновой пленкой. Трансплантация фибробластов проводилась после санации раны (количество микробных тел не более 150 на см2).

Средняя продолжительность лечения (с момента трансплантации аутофибробластов до эпителизации) при локализации язв на стопе составила 8,47 недели, при локализации на голени – 19,3 недели.

У 33% испытуемых сокращение язвенного дефекта в течение первой недели составило до половины язвенной поверхности, у 33% - не менее 27 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи трети. В 33% достигалось незначительное сокращение. На 20 неделе в 88% случаев отмечалась полная эпителизация язв. У одного испытуемого выявлен рецидив язвы, обусловленный нарушением методики использования разгрузочной повязки.

Предварительные результаты свидетельствуют о том, что применение культивируемых фибробластов для закрытия язвенных дефектов кожи в аутогенном варианте у больных сахарным диабетом является безопасным и эффективным. Применение технологии обеспечивает полную эпителизацию язв в период от 9 (при локализации на стопе) до 20 недель (при локализации на голени).

Регуляция активности стромальных и провоспалительных клеток под действием альфа-фетопротеина Зубкова Е.С.1, Меньшиков М.Ю.1, Семенкова Л.Н.2, Дудич Е.И 2, Парфенова Е.В.ФГУ НИИЭК РК НПК Росмедтехнологий ОАО “Институт Инженерной Иммунологии” Ведущиеся в настоящее время исследования возможности повышения эффективности клеточной терапии связаны с поиском биологически активных агентов, усиливающих жизнеспособность клеток после после их трансплантации в поврежденную ткань. Особое внимание привлекают к себе белковые и пептидные молекулы, вовлеченные в процессы эмбрионального развития. В этой связи выглядит перспективным использование альфа-фетопротеина (АФП), основного белка сыворотки, выявляемого на ранних стадиях эмбриогенеза и при развитии раковых опухолей. АФП имеет в своем составе ряд регуляторных эпитопов, определяющих его участие в регуляции иммунитета, клеточной пролиферации, опухолевой активности и ряде других процессов. Проведенное нами исследование показало, что рецептор АФП выявляется в стромальных клетках жировой ткани человека (СКЖТ), однако он представлен в значительно большем количестве на моноцитарных клетках линии THP-1. АФП усиливает пролиферацию СКЖТ, а также их адгезию на фибронектин, уменьшает апоптоз, однако, не оказывает существенного воздействия на их миграцию. Оценивая воздействие АФП на активность воспалительных клеток, мы обнаружили, что он стимулирует инвазию моноцитов THP-1 в матригеле, а также образование этими клетками матриксной металлопротиназы-9 (ММП9), опосреду28 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи емое активацией МАР-киназых каскадов ERK1,2, p38, JNK и активацией фактора транскрипции NFBB. Эти эффекты АФП подавляются препаратом Maraviroc, ингибитором C-C рецептора CCR5, опосредующего клеточные эффекты хемокинов RANTES, MIP-1B и MIP-1B. Нами также получены данные о возможности участия интегринов в сигнальном пути, запускаемом АФП. Таким образом, проведенное исследование показало, что АФП способен оказывать существенное воздействие на инвазивную и секреторную активность моноцитарных клеток. Выраженность этих эффектов, по-видимому, существенным образом определяется плотностью клеточных рецепторов ССR5, и, вероятно, не зависит от активации классического рецептора АФП.





Оптическое трехмерное позиционирование и модификация биологических объектов на клеточном и субклеточном уровне Ракитянский М.М.1,2,3, Карагяур М.Н.1, Агранат М.Б.2, Мухамеджанова Д.М.4, Ашитков С.И.2, Домогатский С.П.5, Овчинников А.В.2, Ситников Д.С.2, Стамбольский Д.В.1, Шевелев И.Н. МГУ, факультет фундаментальной медицины (ФФМ МГУ) Объединенный институт высоких температур РАН (ОИВТ РАН), Москва НИИ нейрохирургии им. Бурденко РАМН, Москва Московский государственный медико-стоматологический университет Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ, Москва Новые возможности, ассоциированные с развитием технологий оптического пинцета и скальпеля, ведут к решению комплексных медико-биологических и медицинских проблем. К таковым относится создание функциональных эквивалентов разных биологических тканей. Для работ в этом направлении в ОИВТ РАН в сотрудничестве с ФФМ МГУ создан комплекс фемтосекундного лазерного пинцета и скальпеля на основе приборной базы, производимой в России. Эта система позволяет прецизионно манипулировать и позиционировать в трехмерном пространстве одиночными или несколькими биологическими объектами микронного и субмикронного размеров. Проводятся работы по оптимизации процесса манипулирования с точки зрения надежности, скорости и безопасности для живых клеток.

Особое внимание уделяется оптическому манипулированию структурнофункциональными элементами нервной ткани млекопитающих, а именно глиальными клетками, телами и волокнами нейронов. Возможности этой 29 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи системы не ограничены типом клеток, и она может быть использована для исследования межклеточных взаимоотношений стволовых клеток и их микроокружения.

Стратегически важным является развитие методов собственно клеточной хирургии, позволяющих производить прецизионную оптическую модификацию биообъектов на клеточном и субклеточном уровне: прецизионное выключение избранных структур клетки, перфорации мембран клеток с целью трансфекции и введения в клетку наноразмерных частиц, суперселективная агрегация и слияние клеток, диссекция структур клеток.

Комбинированное использование оптического скальпеля и пинцета является мостом, соединяющим ультрамикро-наноскопический мир с микро и макроскопическим миром уже разработанных медицинских технологий, и их полные возможности еще предстоит установить.

Экспериментальное обоснование применения аутологичных стволовых клеток костного мозга для лечения костных дефектов и генерализованного пародонтита Кауламбаева М.P.

Научно-производственное предприятие «Антиген», г. Алматы Целью данной работы было обосновать остеорепаративную эффективность применения культур аутологичных стволовых клеток костного мозга при экспериментально воспроизведенных стандартных дефектах костной ткани челюстных костей морских свинок и генерализованного пародонтита, смоделированном на нижней челюсти кроликов.

Применение традиционного метода восстановления костного дефекта под кровяным сгустком имело незначительную эффективность. Площадь костного дефекта в течение 40 суток наблюдения уменьшилась с 19,2±0,мм2 до 10,3±0,4мм2. Эффективность репарации костной ткани составила 46,3 %. Во второй подгруппе: инъекции предкультивированных аутологических клеток костного мозга в сочетании с костным коллагеном в область костного дефекта оказались наиболее эффективными в остеорепарации.

Площадь дефекта через 20 суток уменьшилась до 7,7±0,5мм2, а через суток до 1,2±0,2мм2. Прирост костной ткани составил около 93,6 % от общей площади дефекта.

Существенная разница наблюдалась между применением традиционного метода (контрольная группа) лечения генерализованного пародонтита 30 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи и клеточных технологий в сочетание с костным коллагеном. На 40 сутки эксперимента прирост костной ткани и уменьшение глубины пародонтального кармана в контрольной группе составил 38,77 %, а в испытуемой группе 78,57 %, что более чем в 2 раза больше, чем в контроле.

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать заключение о том, что применением аутологических мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для лечения костных дефектов и генерализованного пародонтита является более эффективным по сравнению с традиционными методами.

Результаты данного эксперимента открывают широкие возможности применения клеточных технологий в ветеринарии и медицине Сравнительный анализ антигенного профиля мезенхимных стромальных клеток из миелоидных органов крыс на разных этапах культивирования in vitro Кожевникова М. Н., Шевелева О. Н., Старостин В. И.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.