WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 12 |

Материалы и методы: исследование проводили на 30 белых беспородных крысах-самцах, которым произвели операцию частичной гепатэктомии по методике Хиггенса и Андерсона. Опытной группе животных (15 крыс) в ходе операции была произведена транслиенальная трансплантация мононуклеарной фракции пуповинной крови человека (1х106 клеток), полученной в градиенте плотности фиколла, контрольной группе — 1 мл. 0,9 % раствора NaCl. Забор органов производили через 2, 5, 7 сутки после операции, материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной методике. Парафиновые срезы печени крыс окрашивали иммуногистохимически с моноклональными антителами к С-kit (маркер стволовых клеток).

Результаты: в срезах печени контрольной группы мы наблюдали экспрессию С-kit гепатоцитами и синусоидными клетками. В срезах печени животных опытной группы С-kit экспрессировался гепатоцитами и мелкими клетками с округлым ядром и узким ободком цитоплазмы, расположенных в портальных трактах и I зоне ацинуса, по фенотипу, напоминающих гепатобласты. Максимальное число С-kit-позитивных клеток в обоих группах наблюдалось через 2 суток после операции, на 5 и 7 сутки происходило постепенное снижение числа этих клеток. При этом, число С-kitпозитивных клеток в срезах печени опытной группы было выше, чем число С-kit-позитивных клеток на аналогичных сроках в срезах печени контрольной группы.

Выводы: трансплантация клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови после частичной гепатэктомии меняет характер активации стволового компартмента печени. Видимо, степень его активации снижается, так как при этом не происходит вовлечения в активацию стволового компартмента синусоидных клеток, выявляемой при классической частичной гепатэктомии.

17 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Применение мягких контактных линз для создания тканеинженерной конструкции роговицы человека Макеев О.Г.1, Коротких С.А.2, Князева Е.С.2, Герасимов М.Ю.2, Зверева А.С.ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия Росздрава» Отдел молекулярных медицинских технологий ЦНИЛ Кафедра глазных болезней В рамках проекта по разработке технологии замещения повреждённой роговицы аутогенными культивированными кератоцитами и эпителиоцитами, проведено сравнительное исследование силикон-гидрогелевых контактных линз из материалов Comfilcon A (Biofinity®), Balafilcon A (Pure Vision®) и Senofilcon A (Acuvue® Oasys) с целью их применения в качестве подложки для культивирования клеток человеческой роговицы.

Использовали семидневные клеточные культуры, полученные из эксплантата лимба от здоровых добровольцев по протоколу, одобренному локальным этическим комитетом. На момент нанесения, культуры содержали кератоциты (85%) и эпителиоциты (15%). Суспензию клеток наслаивали на роговичную поверхность контактной линзы, культивировали в среде DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки в течении суток. В процессе культивирования оценивали адгезивные свойства линз, возможность создания плоскостных клеточных конструкций, соответствующих структуре роговицы.

При исследовании витальных препаратов оказалось, что первичный слой формируют фибробластоподобные кератоциты, с наибольшей эффективностью клонирования на линзах из материалов Сomfilcon A и Balafilcon A. В первом случае колонии были упорядочены. На линзах из Senofilcon A отмечена фиксация отдельных клеток с отсутствием дальнейшего роста.

Формирование монослоя кератоцитов на поверхности линзы завершалось к 7-8 суткам культивирования образованием на монослое колоний эпителиоцитов на линзах из материалов Сomfilcon A и Balafilcon A. Наибольшая площадь колоний эпителиальных клеток наблюдалась на линзах из Balafilcon A.

Таким образом, линзы на основе Comfilcon A и Balafilcon A могут быть использованы в качестве клеточного носителя для аутотрансплантации кератоцитов на поверхности роговицы. Линзы на основе Balafilcon A применимы для создания многослойных эквивалентов роговицы с целью замещения её дефектов.

18 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Аневризма левого желудочка человека как новый источник c-kit- позитивных клеток *Дергилев К.В., **Гмызина А.И., **Рубина К.А., *Парфенова Е.В., *Цоколаева З.И., *Рахмат-Заде Т.М., *Акчурин Р.С., **Ткачук В.А.

*ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий» Москва **Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Факультет фундаментальной медицины, Москва Трансплантация стволовых клеток является перспективным методом при лечении инфаркта миокарда. Для клеточной терапии используются различные источники клеток, включая эмбриональные стволовые клетки, мезенхимальные, гематопоэтические клетки и скелетные миобласты.

В последние годы появились свидетельства того, что сердце содержит пул стволовых и прогениторных клеток (c-kit+, sca-1+, isl-1+), которые обладают способностью in vitro и in vivo дифференцироваться в кардиомиогенном, эндотелиальном и гладкомышечном направлениях, а также предотвращают ремоделирование стенки левого желудочка и стимулируют улучшение функции сердца при введении в ишемизированный миокард.

Стволовые клетки сердца могут быть выделены из кусочков биопсии миокарда человека и культивированы in vitro.

Целью данного исследования было охарактеризовать стволовые клетки сердца в ткани хронической аневризмы левого желудочка. Было проанализировали 15 образцов ткани аневризмы, полученных в ходе ее оперативного иссечения. Методом иммунофлуоресцентного окрашивания была исследована экспрессия маркеров стволовых клеток (c-kit, MDR1), гематопоэтических клеток (CD34, CD45), маркера пролиферации (Ki67), маркеров предшественников и зрелых кардиомиоцитов (Nkx 2.5, Gata-4, Mef2c, alpha-actinin), клеток эндотелия (Ets1, CD105, vW) и гладкомышечных клеток (Gata 6, SMA), а также была проанализирована экспрессия ингибитора клеточного цикла p21. Количество c-kit-позитивных клеток составляло около 3300 на см3 ткани. C-kit-клетки обнаруживались поодиночке в фиброзной, мышечной и жировой частях аневризмы, но преимущественно располагались в фиброзной ткани вблизи крупных сосудов. Ко-экспрессии с-kit и маркеров клеток эндотелия не наблюдалось. C-kit-позитивные клетки также обнаруживались в виде скоплений из 70-100 клеток, однако, экспрессии маркеров кардиомиогенной дифференцировки на них выявлено не было. C-kit-позитивные клетки не являлись клетками гематопоэтического ряда, поскольку не несли маркеров CD34 и CD45. Большинство c-kit-по19 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи зитивных клеток также экспрессировало MDR1, однако, с-kit-позитивные клетки не пролиферировали и не экспрессировали маркеров кардиомиоцитов, клеток эндотелия и гладкомышечных клеток. Около 20% c-kit-позитивных клеток экспрессировали ингибитор циклинзависимой киназы p21.

C-kit-позитивные клетки могут быть выделены из ткани аневризмы с помощью иммуномагнитной селекции и могут быть культивированы в условиях in vitro.

Таким образом, ткань аневризмы левого желудочка человека является источником резидентных стволовых клеток сердца, регенеративный потенциал которых нуждается в дальнейшем изучении.

Методические трудности при культивировании клеток совместно с цеолитами Голохваст К.С., Анисимова А.А., Паничев А.М.

Попытка получить дешевые и эффективные методики направленной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток является одной из самых актуальных проблем современных клеточных технологий. Первым этапом в данном направлении является токсикологическая оценка перспективных индукторов направленной пролиферации. Существуют сообщения о возможности использовании в качестве таких индукторов природных минералов (Кисилева Е. В. и др., 2007). Ранее нами были проведены исследования по влиянию природных минералов — цеолитов на культуру клеток HT 29 (рак кишечника человека) и JB6 Cl41 (нормальные клетки кожи мышей) (Голохваст К. С. и др., 2008).

Также нами предпринята попытка исследования токсического действия цеолитов, на культуру нейтральных стволовых клеток гиппокампа мыши.

При этом установлено, что культивирование клеток in vitro вместе с цеолитами в дозировке 50 мг / мл, предложенной в статьях (Colic M., Pavelic K., 2000, 2002; Pavelic K. et al., 2001, 2002) сопряжено с рядом методических трудностей.

20 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи а б в Рис. а) дифференцированные нейральные клетки, инкубация 48 часов, ув. x б) нейральные клетки, инкубируемые совместно с цеолитом Вангинского месторождения, инкубация 48 часов, ув. x в) нейральные клетки, инкубируемые совместно с цеолитом Лютогского месторождения, инкубация 48 часов, ув. x Во-первых, при культивировании в 6- и 24-луночных планшетах, цеолит в дозировке 50 мг/мл покрывает собой все клетки, прикрепленные к стеклу. В полях зрения клетки практически не видны. Недифференцированные плавающие клетки при пассажах просто вымываются. В итоге оценить токсическое действие или функциональное состояние клеток не представляется возможным. Кроме того, учитывая, что цеолит является водонерастворимым соединением возникает проблема с пипетированием – забиваются носики дозаторов. Третья проблема связана с тем, что при удалении цеолита из культуры происходит практически полная элиминация клеток из лунки – цеолит адсорбирует их на себя. Несмотря на возникшие трудности, некоторые выводы все же сделать можно. Цеолит Лютогского, Ванчинского, Куликовского, Чугуевского, Холинского, Шивертуйского и Вангинского месторождений не проявляет выраженных токсических свойств в дозировке 50 мг/мл, так как во всех экспериментальных группах были отмечены жизнеспособные клетки. К сожалению, статистически достоверных результатов, ввиду вышеуказанных методических сложностей, получить пока не удалось. В ряде случаев, нами были замечены клетки, которые в качестве субстрата для прикрепления использовали частицы цеолита (это хорошо просматривается на приведенных фотографиях см.

рис.1). Можно предположить, что элиминация клеток из лунки при удалении цеолита связана именно с этим наблюдением.

21 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Индукция миогенной дифференцировки стромальных клеток основного вещества пупочного канатика Горкун А.А.1, Сабурина И.Н.1, Кошелева Н.В.1,2, Ревищин А.В.3, Павлова Г.В.3, Репин В.С.НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН Биологический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова Институт биологии гена Доступным и приемлемым с этической точки зрения источником аутологичных низкодифференцированных клеток является пупочный канатик.

Стромальные клетки основного вещества пупочного канатика по ультраструктурным и биохимическими характеристикам сходны с миофибробластам (Kobayashi et al., 1998), они мультипотентны, и, как и мезенхимальные стромальные клетки костного мозга, могут быть использованы в клеточной терапии (Rachakatla et al., 2007). Целью нашей работы стало изучение индукции миогенной дифференцировки стромальных клеток пупочного канатика. Выделенные нами стромальные клетки пупочного канатика экспрессировали CD44, CD90, виментин, фибронектин, коллагены I и IV типов, скелетный миозин, не экспрессировали CD34 и CD45. Для изучения их способности дифференцироваться в миогенном направлении использовали: 1) культивирование в кондиционированной миобластами среде, 2) химическую индукцию, 3) сокультивирование с миобластами. В кондиционированной миобластами среде к пятому дню в культуре стромальных клеток пуповины формировались дикарионы, в отдельных клетках была выявлена экспрессия саркомерного B-актинина. При химической индукции вкультуре стромальных клеток пуповины через 7 – 10 дней формировались симпласты, что согласуется с данными других исследователей (Conconi et al., 2006).

При сокультивировании (1:1) окрашенных DiO стромальных клеток пуповины с миобластами, окрашенными DiI, уже к 4 – 5 суткам наблюдали слияние стромальных клеток пуповины, как между собой, так и с миобластами с формированием симпластов и структур, по морфологии напоминающих миотубы. Полученные результаты расширяют представления о дифференцировочном потенциале стромальных клеток основного вещества пупочного канатика, что подтверждается индукцией миогенной дифференцировки в наших экспериментах под действием химических агентов, секретируемых миобластами факторов, а также через слияние с миобластами.

22 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Особенности фибробластов постожогового рубца Григорьева О.А., Сысоева В.Ю., Рубина К.А.

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Факультет фундаментальной медицины, Москва Фибробласты дермы являются ключевыми участниками процесса заживления раны, при этом фибробласты пролиферируют и выделяют факторы, ускоряющие процессы заживления. Известно, что при термических поражениях больших площадей срок регенерации кожи может значительно увеличиваться, а ожоги третьей и четвертой степени часто сопровождаются образованием гипертрофического шрама. Предположительно, изменение динамики заживления раны в этих случаях связано с системными нарушениями баланса факторов роста, хемокинов и цитокинов в организме и, соответственно, с изменением свойств фибробластов, участвующих в регенерации кожи и формировании рубца. В связи с эти актуальной задачей является исследование механизмов, препятствующих нормальному заживлению ожоговых ран при ожогах большой площади. С целью выявления молекулярных механизмов заживления постожоговых ран было проведено сравнительное исследование уровня факторов роста и цитокинов в крови ожоговых больных и здоровых доноров, а также сопоставление этих данных с результатами цитологических и гистологических исследований.

В результате работы было показано, что на поздних сроках формирования рубца (7, 9 и 11 месяцев после повреждения) в биоптатах рубцовой ткани наблюдается активная пролиферация клеток (7 месяцев), которая к 11 месяцу падает. При этом при изучении апоптоза наблюдается обратная зависимость: процент апоптотических клеток к 11 месяцу возрастает.

Пролиферирующие клетки (Ki67 позитивные) наблюдаются как в составе сосудов, так и в базальном слое кератиноцитов. Единичные пролиферирующие клетки, находящиеся в ткани, вероятно, являлись фибробластами. Однако оказалось, что в отличие от фибробластов нормальной кожи, фибробласты из ожоговой ткани и прилежащей к ней здоровой кожи, выделяемые и культивируемые по стандартной методике, не пролиферируют in vitro.

При анализе содержания факторов роста (VEGF, bFGF, HGF и ангиопоэтина-1) в сыворотке крови пациентов с ожогами больших поверхностей установлено, что уровень этих факторов достоверно выше, чем у здоровых доноров.

Полученные данные свидетельствуют о том, что фибробласты кожи ожоговых больных не пролиферируют in vitro, а в крови у таких пациентов 23 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи уровень факторов роста выше, чем в норме. Эти данные позволяют предположить, что у таких больных происходят системные изменения в организме, которые влияют на свойства фибробластов как в зоне повреждения, так и в прилежащей коже, что может затруднять культивирование фибробластов in vitro.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 12 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.