WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     | 1 |   ...   | 9 | 10 || 12 |

МСК жировой ткани человека 2 – 6 пассажей культивировали по стандартному протоколу в условиях 20 % и 5 % О2. Через 24 после добавления 75 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Фотосенса® (ФС®) (сульфонированный фталоцианин алюминия (ГУП НИОПИК РФ)), 10 мкг / мл, клетки промывали и облучали с помощью лазерного аппарата АЗОР ( = 675 нм) дозами 1 – 2 Дж / см2. Сразу после облучения в среду культивирования добавляли мито- (500 nm) или лизо(100 nm) трекеры на 1 час, а затем анализировали клетки на поточном цитофлуориметре.

Мы показали, что при культивировании в среде с пониженным содержанием О2 увеличивалось количество активных митохондрий в клетках.

В этих же условиях уменьшалось количество МСК, содержащих активные лизосомы. После добавления ФС® в среду культивирования нормоксических и гипоксических МСК возрастали как доля окрашенных лизотрекером МСК, так и интенсивность их окрашивания, что свидетельствовало о закислении лизосомального компартмента клеток, т. е. об активации лизосом.

После ФДВ было выявлено уменьшение доли клеток, содержащих лизо- и митотрекеры, и уменьшение интенсивности флуоресценции зондов в них.

Таким образом, генерация АФК при ФДВ вызывает снижение трансмембранного потенциала митохондрий, тогда как повышение уровня АФК при пониженном содержании О2 не изменяет их функционального статуса.

Работа выполнена при поддержке Госконтракта Миннауки № 02.518.11.7141.

Allogenius transplantation of chorionic stem-progenitor cells at normothermic reperfusion of kidney received from non-heart beating rats Alexander N. Kharlamov1, Ciryl Moers, Jan L. GbainskyDepartment of surgery, University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands; 1Urals State Medical Academy, Yekaterinburg, Russia Background. An increase of the non heart beating donors is one of the main strategies of the donorpool expansion. The key problem is a certain inevitability of the allograft ischemic and reperfusion damage. We designed this research for experimental searching of the new preservation and perfusion models.

Methods. A total of 60 rats (Lewis) were assigned to the group with using of chorionic stem-progenitor cells (CSPS) in the composition of UW-solution and perfluorinecarbon emulsion (30 rats), and to the control group (without CSPS, 30 rats). The primary outcome is a histological degree of graft delayed function, and chronic allograft nephropathy.

Results. Delayed graft function was revealed in 2 (9.1%) CSPS rats, and 76 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи (35%) controls. Beyond one year, a later phase of chronic allograft nephropathy (59% in CSPS rats as compared with 90% of control) was characterized by microvascular and glomerular injury (p<0.001 for both comparisons).

Progressive high-grade arteriolar hyalinosis with luminal narrowing, increasing glomerulosclerosis, and additional tubulointerstitial damage that was achieved at one year in 40.9% of CSPS rats as compared with 75% of control (p<0.001).

Serum creatinine was 1.8 mg/dl at the beginning of research and was detected as 3.5 mg/dl at one year in control as compared 2.4 mg/dl in CSPS rats. Urine production was much more higher (on 35%, p<0.005) in CSPS rats at the finish. Protein concentration was changed from 5.8 mg/ml to 12.4 mg/ml in control, and to 8.7 mg/ml in CSPS rats. The difference between histological damage (by Banff score) at one year was 28% (p<0.001). Unfortunately at second year the advantage of SC’s technology was just 5% (p<0.001 for both comparisons). Transplanted CSPS had a suppressed influence over activity and migration of the host mesenchymal SCs. There were CSPS as cells-regulators affecting for activity and migration of host local kidney stem cells. Autoimmune response (TGF beta-1, IL-6, IL-17) was depressed at one year (minus 62%, p<0.001) and was increased at second year (more than 67%, p<0.001).

Conclusions. The using of CSPS is effective for prevention of graft delayed function, and a decrease of chronic allograft nephropathy degree that is increasing viability of the graft. Used technique leads to decreasing of calcineurin-inhibitor nephrotoxicity. Transplanted SC’s inhibited activity and migration of bone-marrow stem cells. The great problem is an autoimmune and protooncogenic response for SC’s transplantation.

Key words: kidney transplantation, chorionic stem-progenitor cells, non heart beating donors.

Характер встраивания эмбриональных стволовых клеток после микроинъекции в развитии зародышей мыши in vitro Храмцова Е.А., Капралова И.В.

Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Московская область e-mail: hramelan@gmail.com Для получения трансгенных животных широко применяют микроинъекцию эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), несущих чужеродную генетическую информацию. Для исследования характера встраивания модифицированных клеток в ткани зародыша и их дальнейшей дифференцировки 77 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи используют ЭСК с экспрессией GFP белка. Также, представляет интерес вопрос об изменении экспрессии гена gfp в раннем развитии зародышей in vitro после микроинъекции стволовых и соматических клеток. В работе использовали клетки внутренней клеточной массы (ВКМ) из бластоцист мыши линии C57Bl / 6TgN (FGP) с экспрессией гена gfp, и первичные эмбриональные фибробласты (ПЭФ) зародышей той же линии. Также, использовали эпителиальные клетки Cos-1, трансфецированные геном gfp.

Предварительно для микроинъекции под флуоресцентным микроскопом отбирали светящиеся клетки, несущие белок GFP. Все клетки вводили в бластоцисты мыши линии MNRI, в количестве по 7–10 клеток ВКМ и ПЭФ и по 3 – 5 клеток Cos-1, после чего бластоцисты культивировали в стандартных условиях в течение 72 часов.



С помощью конфокальной сканирующей микроскопии было показано, что клетки Cos-1 и ПЭФ, экспрессирующие флуоресцентный белок, через 24 ч и 48 часов после микроинъекции обнаруживались в области трофобласта. Также после 48 ч культивирования, клетки зародыша выходили из z. pellusida и формировали колонии эмбриональных стволовых клеток.

Светящиеся клетки ПЭФ и Cos-1 также обнаруживались среди клеток трофобласта, при этом наблюдалось значительное снижение интенсивности флуоресценции GFP и полное исчезновение свечения через 72 ч культивирования в двух линиях клеток.

Клетки ВКМ с постоянной экспрессией FGP после микроинъекции в бластоцисты встраивались в зародыш случайным образом, как в клетки трофобласта, так и во внутреннюю клеточную массу. Свечение GFP уменьшалось или полностью исчезало в области ВКМ уже через 48 ч культивирования, тогда как свечение клеток в области трофобласта было более интенсивным.

Система ко-культивирования мезенхимальных стволовых клеток и клеток нейробластомы SH-SY5Y: новая модель in vitro для скрининга биологической активности веществ Шафигуллина А.К.1, Блат Н.Л.2, Ризванов А.А.1, Казанский государственный медицинский университет, Казанский государственный университет В биомедицине остро стоит проблема изучения этиологии и патогенеза рака, процессов малигнизации и метастазирования, создания клеточных систем in vitro для доклинического тестирования противораковых препара78 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи тов. Широко применяемая в настоящее время система скрининга противораковых препаратов, разработанная в 1985 году в Национальном Институте Рака, США, несмотря на свою техническую простоту, не позволяет точно моделировать биологические процессы в контексте сложной трехмерной структуры опухолей и взаимодействия раковых клеток с их микроокружеием. В результате этого наблюдается низкая корреляция результатов скрининга противораковых препаратов in vitro и in vivo. Существует несколько альтернативных тест-систем (раздельные ко-культуры, органотипические и сфероидные культуры, и т. п.), они также имеют ряд недостатков. Сложность заключается в моделировании межклеточных взаимодействий и упрощении анализа компонентов тест-системы.

Для решения этой проблемы нами было проведено ко-культивирование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и клеток нейробластомы SH-SY5Y человека на различных биологических субстратах. Каждая клеточная популяция была мечена специфичным витальным флюоресцентным красителем, что позволило проводить анализ ко-культуры в реальном времени с помощью флюоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Ко-культивировании клеток на поли-Л-лизине, фибронектине, желатине, коллагене и немодифицированном культуральном пластике приводило к спонтанной самоорганизации клеток — «островки» раковых клеток окруженные «протоками» фибробласто-подобных МСК — напоминающей гистологический срез метастатических очагов. При культивировании на поверхности, покрытой слоем Матригеля, наблюдалось формирование плотного сгустка МСК, окруженного «ореолом» клеток SH-SY5Y. Кокультивирование клеток на немодифицированном культуральном пластике привело к повышению жизнеспособности раковых клеток в 2 раза по сравнению с чистой культурой SH-SY5Y в условиях окислительного стресса, что согласно литературным данным наблюдается в экспериментах in vivo.

Разработанная клеточная тест-система является новым подходом в моделировании межклеточных взаимодействий, позволяет проводить анализ каждого из клеточных компонентов в реальном времени, демонстрирует качественное изменение свойств раковых клеток в ко-культуре и служит основой для разработки эффективной доклинической модели скрининга препаратов для практического здравоохранения.

79 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Мезенхимальные стволовые клетки пуповинной крови и костного мозга человека как источник «нейросфер» при нейрогенной индукции Шахбазов А.В.1, Петевка Н. В.2, Космачева С.М.2, Картель Н.А.1, Потапнев М.П. Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь E-mail: shakhbazau@gmail.com РНПЦ гематологии и трансфузиологии, Минск, Беларусь Для стволовых клеток нервной ткани, а также индуцированных в нейрональном направлении других типов стволовых клеток (в частности, эмбриональных), характерным этапом является формирование флотирующих сферических агрегатов клеток, получивших название «нейросфер». При дальнейшем высеве на соответствующие субстраты клетки, составляющие нейросферы, дают начало нейрональному и олигодендроглиальному направлениям дифференцировки. Подобные клеточные агрегаты, несущие характерные для нейросфер микроотростки, были получены нами при культивировании МСК костного мозга и пуповинной крови в нейрогенной среде NeuroCult с добавлением 20 нг / мл EGF и 10 нг / мл FGFb в низкоадгезивных условиях на 2 – 4 день. При этом, МСК пуповинной крови характеризовались существенно более быстрым образованием нейросфер, их большим количеством (до 260 сфер на 10000 высаженных клеток) и размерами. Количество нейросфер из МСК костного мозга существенно варьировало в зависимости от донора и, как правило, не превышало 5 – на 10000 высаженных клеток на 7-й день дифференцировки. Как для костного мозга, так и для пуповинной крови было характерно резкое падение способности генерировать нейросферы по мере пассирования. При дальнейшем высеве нейросфер часть клеток приобретала нейроноподобный фенотип и экспрессировала ряд ранних нейрональных маркеров (нестин, NSE, -III-тубулин). Разработка и внедрение методов нейрогенной дифференцировки МСК может существенно расширить потенциал клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний и травм нервной системы.





80 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Создание клеточного продукта на основе клеток кожи человека - кератиноцитов и биодеградируемой полимерной плёнки Швед Ю.А.1,2, Блинова М.И.1, Билибин А.Ю.2, Пинаев Г.П.Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет Проблема восстановления повреждённых органов и тканей является перспективным направлением современной регенеративной медицины.

Одним из приоритетных направлений регенеративной медицины является восстановление структурной целостности кожных покровов, повреждённых в результате ожогов, трофических язв и воздействий другого рода. Для этой цели выращенный in vitro клеточный пласт эпителиальных клеток — кератиноцитов должен быть перенесён на поражённый участок кожи. Однако для отделения клеточного пласта от поверхности культурального сосуда, необходима обработка протеолитическими ферментами. Такая обработка приводит к частичному повреждению рецептров, находящихся на поверхности клеток. Полимерные матрицы, позволяющие культивировать на них кератиноциты человека с образованием многослойного клеточного пласта, при совместном переносе их в область повреждения позволят исключить процедуру обработки клеток, выращиваемых по известным технологиям, протеолитическими ферментами и ускорить процесс заживления ран.

Цель исследования — разработка биодеградируемой полимерной матрицы, предназначенной для культивирования клеток кожи человека с целью их трансплантации на повреждённый участок кожи.

В процессе исследования были решены следующие задачи: отработаны условия формирования полимерных плёнок для свободного доступа к клеткам питательных веществ и отвода продуктов метаболизма и определена скорость их деградации в условиях культивирования клеток и после имплантации в организм лабораторных животных. Разработаны методы модификации поверхности полимерных плёнок и подобраны оптимальные условия для культивирования клеток кожи на этих плёнках.

81 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи Генетически модифицированные стромальные клетки жировой ткани, секретирующие VEGF, стимулируют ангиогенез in vivo Шевченко Е.К., Цоколаева З.И., Сысоева В.Ю., Парфёнова Е.В.

Федеральное государственное учреждение Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий Введение. Наиболее перспективное направление в клеточной трансплантологии – использование генетически модифицированных клеток – своеобразный альянс клеточной и генной терапии. Стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) благодаря возможности выделения их в большом количестве у пациентов при минимальном хирургическом вмешательстве, а также высокому уровню экспрессии ими различных митогенных, антиапоптотических и ангиогенных факторов могут стать важнейшим инструментом клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. В данной работе мы изучали возможность использования СКЖТ для доставки гена человеческого фактора роста сосудистого эндотелия, VEGF, с целью стимуляции ангиогенеза.

Материалы и методы. Для генетической модификации клеток использовали непатогенный для человека рекомбинантный аденоассоциированный вирус (рекААВ) серотипа 2 (Stratagene). СКЖТ человека выделяли из жировой ткани доноров, взятой при хирургической операции. Клетки на ранних пассажах трансдуцировали рекААВ, несущим ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), либо VEGF. Эффективность трансдукции клеток определяли микроскопическим анализом и методом проточной цитофлуориметрии. Уровень экспрессии трансгена анализировали с помощью иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Для того, чтобы определить эффект секреции VEGF модифицированными СКЖТ на прорастание сосудов, использовали модель подкожной имплантации матригеля иммунодефицитным мышам.

Результаты. С помощью проточной цитофлуориметрии определили наличие в популяции СКЖТ клеток, которые несут на своей поверхности гепарансульфат протеогликан, рецептор, через который происходит связывание вируса с клеткой. Было показано, что 55-65% популяции СКЖТ экспрессируют данный белок. Эффективность трансдукции СКЖТ рекомбинантным вирусом, выраженная в процентном содержании флуоресцирующих, GFP-позитивных, клеток, составила 60+/-7%. Флуоресценцию GFP наблюдали, в течение месяца. Клетки, трансдуцированные вирусом с VEGF, секретировали в 30 раз большее количество белка по сравнению 82 Всероссийская научная школа-конференция для молодежи с немодифицированными клетками. Кроме того, VEGF-секретирующие СКЖТ стимулировали прорастание сосудов и значительно увеличивали васкуляризацию матригеля у иммунодефицитных мышей.

Таким образом, показана возможность использования рекомбинантного аденоассоциированного вируса человека для доставки терапевтического гена в стромальные клетки жировой ткани человека. Генетически модифицированные СКЖТ, секретирующие VEGF, значительно лучше стимулируют ангиогенез по сравнению с немодифицированными клетками.

Появление маркеров первичных половых клеток в эмбриональных стволовых клетках человека культивируемых в среде обогащенной факторами дифференцировки в условиях отсутствия фидера и сыворотки Шеина Ю.И., Еремеев А.В.

Pages:     | 1 |   ...   | 9 | 10 || 12 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.