WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 |
BIOSENSORS БИОСЕНСОРЫ S. D. VARFOLOMEEV..

Biosensors are the bio- ‚ „‰‡‚ ‚... ‚‡ electronic devices which use the biomacromolecules and cells for “recogВ последнее десятилетие возникли новые конnition” of molecules and такты на первый взгляд между очень далекими областями: электроникой и биохимией. Их взаимное transform the information проникновение друг в друга создало новую сферу about molecules and their интересов науки – биоэлектронику. Первым шагом concentrations into elec- в этой области было возникновение новых устройств для анализа и переработки информации, получивtric signal. Principles of ших название биосенсоров. Биосенсоры рассматриconstruction and action of ваются как первое поколение биоэлектронных устbiosensors are described. ройств.

The enzyme electrodes Что же такое биосенсоры Как они устроены Как работают Что могут Постараемся ответить на and cellular biosensors эти вопросы. Биосенсоры – это аналитические устare discussed in more ройства, использующие биологические материалы details. для “узнавания” определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала.

·‰‡fl Идея создания такого рода устройств существует ‰‚fl ‚уже около 30 лет. Впервые ее высказали, по-види ·‚ – - мому, Кларк и Лионс в 1967 году [1]. Идея Кларка состояла в использовании ферментного электрода, ‚ ‡‡ то есть электрохимического датчика с иммобилизо‚, ванным на его поверхности ферментом. За прошед·„ ‡‡- шие десятилетия эта идея получила достаточное развитие. Создано и исследовано много систем, не ‰fl “‡‚‡fl” которые получили апробирование и промышлен ‰‡ ную реализацию.

‡ · Большинство биосенсоров ориентированы на ‚ ‚ ‚ ‚‰ анализ биологических жидкостей. Действительно, например, в крови находятся тысячи различных со„ „‡единений. Задача заключается в том, чтобы быстро ‡. ‰‡ ‡и эффективно (количественно) определить концен трацию нужного соединения, например глюкозы.

Для людей, страдающих диабетом, это жизненно ‰ важный клинический анализ. Биосенсоры обеспе·.

чивают такую возможность.

Принципы конструирования биосенсоров. Любой биосенсор состоит из двух принципиальных функциональных элементов: биоселектирующей мембраны, использующей различные биологические структуры, и физического преобразователя сигнала (трансдьюсера), трансформирующего концентрационный сигнал в электрический. Для считывания и записи информации используют электронные системы усиления и регистрации сигнала. В качестве биоселектирующего материала используют все типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые кислоты и даже живые клетки (рис. 1).

..

© ‡‚.., сенсоре на глюкозу с участием глюкозоксидазы Вещество, концентрационный Биоселектор Трансдьюсер используется следующая реакция:

сигнал Глюкоза + O2 Глюконолактон + H2OH2O Ферменты Клетки Глюконовая Антитела Рецепторы кислота Соответственно электрохимическая детекция Нуклеиновые кислоты процесса может быть организована путем регистрации тока восстановления кислорода или перекиси водорода. Оба случая реализованы на практике. В Запись и преобразование информации амперометрических биосенсорах поток электронов через поверхность датчика линейно связан с концентрацией анализируемого вещества в растворе.

Рис. 1. Принципиальная схема биосенсора При адсорбции ферментов на твердых поверхностях (металлы, керамика, полимеры) они, как Трансдьюсерами могут быть электрохимические правило, сохраняют свою структуру и каталитичеспреобразователи (электроды), различного рода опкую активность. Фермент в режиме амперометритические преобразователи, гравитационные, калоческого биосенсора проявляет электрокаталитичесриметрические, резонансные системы. Все виды кую активность, то есть ускоряет процесс обмена биоселектирующих элементов можно комбинироэлектронами между субстратом и электродом.

вать с различными трансдьюсерами. Это создаст Электрокаталитический транспорт электронов большое разнообразие различных типов биосенсоможет быть осуществлен несколькими принципиров. В статье невозможно сколь-нибудь подробно ально различными путями (рис. 2).

рассмотреть все имеющиеся в настоящее время типы биосенсоров. Наибольшее развитие получили 1. Перенос электронов протекает с помощью ферментные и клеточные биосенсоры. диффузионно-подвижного промежуточного низкомолекулярного переносчика электронов – медиатора. Схему процесса можно представить в виде S + E P + E0 E0 + M E + MФерментативный катализ обеспечивает биоселектирующими возможностями основную массу Электрод M0 M+–e-, современных биосенсоров. Сопряжение ферментативно-каталитических и электрохимических реак- где E и E0 – окисленная и восстановленная формы ций, происходящих на электропроводящих материа- активного центра фермента; М и М0 – окисленная и лах, погруженных в раствор электролита, позволило восстановленная формы медиатора.

разработать много биосенсоров для определения Медиатор должен быть достаточно специфичесглюкозы, аминокислот, молочного сахара, пируваким субстратом фермента и быть электрохимически та, мочевины и других метаболитов.

активным на электроде из данного материала. Медиаторный механизм транспорта электрона достаточно Первая, предложенная Кларком система основана на электроде, измеряющем в диффузионно-контролируемом режиме количество поглощенного кислорода. Было применено большое число оксидаз, использующих кислород для селективного окислеS S ния углеводов, аминокислот, органических кислот.

e Наиболее удобно проводить измерения на ферP Mментных электродах в амперометрическом режиме, то есть измерять силу тока (поток электронов) через поверхность электрода. Сила тока как скорость реакции может быть однозначно связана с концентра- Me цией измеряемого компонента.



Простейший случай в конструировании ферM ментного биосенсора реализуется при условии, что либо субстрат, либо продукт ферментативной реак- ции электрохимически активны, то есть способны быстро и желательно обратимо окисляться или восРис. 2. Механизмы переноса электрона между станавливаться на электроде при наложении на неактивным центром фермента и электродом: 1 – го соответствующего потенциала. Например, в био- медиаторный перенос; 2 – прямой перенос, ‹1, сигнал Электрический широко используется для проведения электрохи- Наблюдаемые эффекты не зависят от природы мических ферментативных реакций. электрода. Электрохимические измерения проводили на электродах из сажи, пирографита, стеклоугле2. Происходит прямой электрокаталитический рода или золота. Иммобилизацию лакказы осущеперенос электронов между электродом и активным ствляли адсорбционным способом непосредственно центром фермента. Например, в атмосфере кислона электрод. В присутствии кислорода и лакказы рода в присутствии медьсодержащей оксидазы – наблюдалось увеличение потенциала для всех исслелакказы из Poluporoz versicolor, сорбированной на дуемых электродов. Максимальное значение потенэлектродах из различных материалов, устанавливациала +1,207 В, близкое к равновесному потенциалу ется потенциал, близкий к термодинамически равкислородного электрода, устанавливалось на электновесному потенциалу кислорода. При этом имеет родах из сажи, которые предварительно были выдерместо стадия переноса электронов из электрода на жаны в растворе лакказы (10- 5 М) в течение суток.

активный центр фермента. Описано и электрокатаАдсорбция фермента на электродах из сажи литическое восстановление пероксида водорода с практически необратима. После иммобилизации помощью иммобилизованной пероксидазы, протеэлектрод сохраняет каталитические свойства при кающее по такому же механизму.

отсутствии лакказы в растворе. Ферментативная 3. При включении ферментов в органические природа электрокатализа была доказана специфичеполупроводники (органические металлы) можно ским ингибированием электрокатализа фторид- и наблюдать перенос электронов между активным азид-ионами, инактивацией фермента прогреваницентром фермента и доменами в полупроводнике.

ем, сопоставлением рН-зависимости электрокаталиВсе эти механизмы транспорта электронов активно тических эффектов и каталитической активности в используются при конструировании биосенсоров.

реакции окисления феррицианид-иона кислородом.

Если медиаторный перенос электрона – доста- Таким образом, наблюдаемый электрохимичесточно традиционный путь сопряжения электрохи- кий процесс на электроде с иммобилизованной мической и ферментативной реакций, то прямой лакказой определяется реакцией четырехэлектронперенос, в котором фермент играет роль истинного ного восстановления кислорода до воды электрокатализатора, представляет большой интеO2 + 4e- + 4H+ 2H2O.

рес. Остановимся на этом более подробно.

Кислородные электроды на основе иммобилиВпервые явление биоэлектрокатализа с участизованной лакказы достаточно стабильны. Прямой ем прямого переноса электронов электрод – активэлектрокаталитический механизм переноса элекный центр фермента было обнаружено и исследоватронов обнаружен и исследован для лакказы, пено при изучении реакции электрохимического роксидазы, гидрогеназы.

восстановления кислорода с участием медьсодерПри конструировании биосенсоров наибольшее жащей оксидазы – лакказы [2, 3]. В классической применение нашел феномен электровосстановления электрохимии электровосстановление кислорода – перекиси водорода с помощью иммобилизованной одна из наиболее сложных проблем. Известно, что пероксидазы. Приведем несколько примеров.

равновесный потенциал окисления–восстановления пары О2/Н2О, равный 1,23 В, устанавливается Определение ряда ключевых метаболитов. Мнолишь на предварительно специально обработанной гие ферменты осуществляют оксидазную реакцию с платине и в особо чистых растворах. В то же время различными веществами (глюкоза, аминокислоты) известны ферменты, которые активно восстанавли- с образованием перекиси водорода. В этом случае вают кислород по четырехэлектронному механизму пероксидазный электрод используется для трансдо воды без промежуточного образования в растворе формации концентрационного сигнала в электрипероксида водорода. Лакказа является медьсодер- ческую форму. При совместной иммобилизации жащим ферментом, осуществляющим четырехэлек- двух ферментов – оксидазы и пероксидазы проходят тронное восстановление кислорода при использова- следующие процессы:

нии в качестве донора различных ароматических Оксидаза АН2 + О2 А + Н2О2, аминов и фенолов. В активный центр фермента входят четыре иона меди, осуществляющие коордиН2О2 Н2О + 2e-.

Пероксидаза нированное восстановление кислорода.

В электрокаталитическом режиме Известно, что электровосстановление кислороВ условиях, когда лимитирующей является перда в нейтральных или слабокислых растворах на вая стадия, величина тока линейно связана с конугольных материалах протекает со значительным центрацией метаболита АН2.

перенапряжением. При введении в систему лакказы в незначительных количествах (10- 9 М) было заме- Определение супертоксинов и боевых отравляючено существенное смещение стационарного по- щих веществ. Большая группа фосфоорганических тенциала в область положительных значений и ус- соединений выступает в роли сильных ядов, блокорение электровосстановления кислорода. кируя в центральной нервной системе фермент..





ацетилхолинэстеразу. По аналогичному механизму ределенная корреляция: емкость носителя до 100 мг действуют большинство пестицидов. Были разрабо- белка на 1 г полимера. В последние годы широкое таны биосенсоры для детекции такого рода соеди- распространение получили органические полупронений с необходимой высокой чувствительностью. водники при электрохимической полимеризации Ферментативные реакции, которые использованы ароматических соединений непосредственно на для этих целей, выглядят следующим образом: электроде (полипирол, полианилин, полимер метиленовый синий).

Ацетилхолинэстераза ацетилхолин 2. Полимеры с комплексами переноса заряда Ацетилхолинэстераза (КПЗ). Предельным вариантом сильных КПЗ явля холин + уксусная кислота, ются ион-радикальные пары. В системах с КПЗ, так холин + О2 Холиноксидаза Н2О2 + оксихолин, же как и в системах с полисопряжением, электропроводность обеспечивается за счет -электронов, Н2О2 Н2О + 2e-.

Пероксидаза но делокализация их происходит в плоскостях, перВ электрокаталитическом режиме пендикулярных плоскостям, упакованных в пачки молекул. Механизм проводимости обусловлен ионИнгибитор (зарин, зоман, Vx) блокирует акрадикальным диспропорционированием в пачках, тивность ацетилхолинэстеразы, в конечном итоге состоящих из доноров и акцепторов электронов.

уменьшая пероксидазный электрокаталитический Классическим примером проводников, действуюток через поверхность электрода. Чувствительность щих по ион-радикальному механизму, являются собиосенсора доведена до 10- 12 М нейротоксина.

ли на основе тетрацианхинодиметана (TCNQ). ПроОдин из подходов к осуществлению переноса элекводимость в таких системах обычно связывают с тронов между активным центром фермента и элекобразованием КПЗ между молекулами TCNQ.

тродом заключается в использовании для иммобилизации ферментов матриц проводникового и Способ получения таких иммобилизованных полупроводникового характера. ферментов заключается в соосаждении поликатионов с ферментами под действием полувосстановБольшой класс потенциальных носителей при ленной соли TCNQ. Фермент иммобилизуется в создании биокатализаторов составляют органичесводопроницаемые полимеры с высокой электрокие полимерные полупроводники. Электропроводпроводностью (вплоть до 10- 2 Ом- 1 см- 1). Емкость ность полупроводниковых полимеров может изменосителей – до 500 мг белка на 1 г носителя.

няться в широком интервале (10- 15–104 Ом- 1 см- 1) и приближаться к электропроводности металлов. Для Использование новых материалов органических иммобилизации ферментов интерес представляют полупроводников с включенными в них ферментапо крайней мере два класса органических полупроми позволило создать новое поколение биосенсоров.

водников.

В некоторых случаях электрохимические биосенсо1. Полимеры с системой сопряженных связей, об- ры удобно реализовывать в форме потенциометриладающие длинной цепью сопряжения. Они имеют ческих ячеек с измерением смещения потенциала сравнительно высокую электропроводность и пред- электрода, возникающего за счет электрохимичесставляют собой электронно-неоднородные системы, кой реакции. Калибровочная кривая в этом случае в которых области полисопряжений, характеризуе- коррелирует смещение потенциала и логарифмичемые “металлической” проводимостью, разделены ское значение концентрации аналита.

диэлектрическими участками. Перенос электронов через диэлектрические участки определяет общий барьер транспорта электронов.

Одно из достижений биотехнологии и биоинжеТермически обработанный полиакрилонитрил нерии связано с развитием методов включения жиявляется достаточно хорошо изученным полимервых клеток в полимеры и твердые носители различным полупроводником. Электропроводность образной природы и применением такого рода материалов цов зависит от температуры термической обработки.

для решения задач медицины, управляемого биосинНосители были химически модифицированы окистеза, анализа. С использованием живых иммобилилением концентрированной азотной кислотой зованных клеток создано много различных биосен(введение нитро- и гидроксигрупп), обработкой соров [4]. Можно отметить несколько удивительных гидразином и восстановлением с образованием свойств иммобилизованных клеток.

аминогрупп. Иммобилизацию ферментов проводили на окисленных образцах термически обработан- 1. Клетки – доступный биологический материного полиакрилонитрила после гидрогенолиза и ал. Используют клетки растений, животных, человосстановления с использованием бифункциональ- века, но наибольшее применение нашли клетки ного реагента – глутарового альдегида. Интересно микроорганизмов, которые культивируются, легко отметить, что между степенью окисления термичес- воспроизводятся и поддерживаются в чистой кульки обработанного полиакрилонитрила и активнос- туре. В отличие от ферментов при использовании тью иммобилизованного фермента существует оп- клеток не требуется дорогостоящих стадий очистки.

, ‹1, 2. Имеющиеся методы иммобилизации позво- рода пористый материал, сохраняют активность и ляют получить клетки, сохраняющие около 100% способны функционировать в течение нескольких активности ферментов и способные функциониро- месяцев.

вать достаточно длительные промежутки времени.

Применения клеточных биосенсоров достаточКлетки сохраняют все наиболее важные структуры и но многообразны. Созданы биосенсоры для селекпроявляют большую стабильность. В некоторых слутивного определения фенолов, пролина, глутамичаях клетки сохраняют жизнеспособность и активна, тирозина, молочной и аскорбиновой кислот, ность ферментных систем в течение нескольких лет.

Pages:     || 2 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.