WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 |
БИОЛОГ ИЯ БИОЛОГ ИЯ ЗАЧЕМ НУЖНЫ ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ М. Л. СЕМЕНОВА Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова ВВЕДЕНИЕ С давних времен человек методом искусственного отWHY ARE бора создавал сорта культурных растений и породы TRANSGENIC ANIMALS сельскохозяйственных животных для питания и других NEEDED хозяйственных нужд. Современные методы генетики и селекции позволили многократно ускорить этот проM. L. SEMENOVA цесс. Селекция проводилась для увеличения продуктивности, плодовитости и урожайности, устойчивости к Almost 20 years have passed since the publicaвредителям и заболеваниям, неблагоприятным условиtion of an article in the “Nature” which ям среды, для улучшения вкуса, внешнего вида, лежкости плодов и овощей, для повышения содержания белreported on the giant mice born after the rat's ка в зерне, жирномолочности коров и многого другого.

gene of growth hormone had been introduced Однако основой всех этих работ был собственно геном into the zygote. Since then, animals have been того вида, который использовался в селекционной раcreated which produce human-like medicinal боте, и все возможности всегда были ограничены этими proteins, others which simulate various human рамками. В последние десятилетия XX века был предложен способ перешагнуть через этот барьер и придать diseases, still others with “knocked-out” культурным растениям и сельскохозяйственным животgenes, the latter serving as a model to study ным свойства и признаки, которыми они не обладали functions of various genes.

ранее. Этот способ – создание трансгенных организмов.

В наши дни трансгенные растения и животные уже Почти 20 лет прошло после публикации в перестали быть редкостью. Сегодня границы их исполь“Nature”, где сообщалось о гигантских мы- зования обсуждаются не только в научной литературе, но и в средствах массовой информации. Эта область бишах, рожденных после введения гена гормоотехнологии так или иначе касается многих сторон на роста крысы в зиготу. С тех пор были жизни современного общества, но в данной статье не получены животные, продуцирующие лекарбудут затронуты социальные, этические или юридичественные белки человека, моделирующие ские аспекты создания и использования трансгенных различные заболевания человека, и живот- животных – это предмет отдельного обсуждения. Здесь будет дан только обзор современного состояния этой ные с выключенными генами – модели для области, возможности использования трансгенных жиисследования функций различных генов.

вотных и перспективы развития этого направления исследований на ближайшие годы.

В современной биотехнологии широко используют трансгенные микроорганизмы, в геном которых введены различные гены эукариот. Трансгенные растения несут гены, обеспечивающие повышенную соле- и засухоустойчивость, устойчивость к вредителям и болезням [1]. Но если растения с такими качествами могут быть получены и с помощью методов традиционной www.issep.rssi.ru селекции, хотя и с большей затратой сил и времени, то трансгенные животные часто являются единственной СЕМЕНОВА М.Л. ЗАЧЕМ НУЖНЫ ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ Семенова М.Л., © БИОЛОГ ИЯ надеждой тяжелобольных людей на получение необхо- высоким содержанием цинка, который стимулировал димых им лекарств. работу металлотионинового промотора. Ген крысы активировался, продукция пептидного гормона роста резВ ранних работах трансгенными животными назыко увеличивалась, и в возрасте 10 недель трансгенные вали только тех, которые были получены путем микромыши были в два раза крупнее, чем контрольные.

инъекции чужеродной ДНК в зиготу и которые несут чужеродный ген в составе своего генома, так как других Существуют две основные схемы получения трансвариантов создания трансгенов еще не было. Часто в генных животных. Первая из них – микроинъекция чуэтом значении термин “трансгенные животные” упо- жеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку – зиготребляется и сейчас. Однако в последнее время к этой ту, разработанная для получения трансгенных мышей, категории относят всех животных, полученных в резуль- позднее стала применяться и для получения крупных тате генноинженерных воздействий, в том числе живот- животных – продуцентов лекарственных белков челоных, созданных при помощи эмбриональных стволовых века: кроликов, коз, овец, коров (рис. 1). Первый этап клеток, и животных с выключенными генами, так на- такой работы – это создание генетической конструкзываемых нокаутов. Иногда к трансгенным животным ции с заданными свойствами. Так, если исследователь относят и тех, которые были подвергнуты соматичес- хочет создать трансгенное животное, у которого чужой кой трансфекции, то есть которым чужеродный ген вве- ген экспрессируется в клетках эпителия молочной жеден был непосредственно в определенный орган или лезы и его продукт выделяется в молоко, то создаетткань взрослого организма. ся конструкция, содержащая рекомбинантную ДНК трансгена и промотор гена -казеина – белка, входяКАК СОЗДАЮТ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ щего в состав молока. В идеальном случае эта конструкция должна работать только в клетках молочной В 1982 году на обложку одного из номеров журнала железы и только во время лактации, не оказывая побоч“Nature” поместили фотографию из статьи Р.Д. Пального воздействия на организм трансгенного животного.

митера с соавторами, опубликованной в том номере.

В настоящее время, когда методы работы с эмбрионами На ней рядом сидят две десятинедельные мыши. Одна млекопитающих достаточно хорошо разработаны и из них, полученная после введения в зиготу гена гормобольшой процент эмбрионов выживает и нормально на роста крысы, в два раза больше другой, контрольной развивается после микроинъекции, именно генетичес(их вес 41,2 и 21,2 г). Экспрессия гена крысы привела к кая конструкция является тем фактором, который оптому, что трансгенная мышь стала мышью-гигантом.



ределяет, будет ли трансгенное животное иметь желаеЭто была не первая попытка ввести чужой ген в эмбримые свойства или нет. Генная конструкция в составе он, но именно после публикации той статьи началось бактериального вектора клонируется на культуре баксоздание трансгенных животных, обладающих новыми терий Escherichia coli, выделяется и переводится в линенаследственно заданными свойствами. Особо важное арную форму, которая лучше встраивается в геном эмместо среди этих исследований сразу же заняли работы бриона, чем кольцевая ДНК.

по получению трансгенных млекопитающих. Это направление биотехнологии возникло, с одной стороны, На следующем этапе работы генетическую констна основе бурного развития экспериментальной эмб- рукцию инъецируют в одноклеточный эмбрион – зигориологии, а с другой – на основе достижений молеку- ту. В зиготе генетический материал, полученный от отлярной генетики. Еще в 60-е годы XX века были разра- ца и матери, находится в двух пузырьках, окруженных ботаны методы получения ранних эмбрионов мыши, ядерной мембраной, – в мужском и женском пронуких культивирования in vitro на синтетических средах, леусах. Необходимое количество копий генетической методы пересадки этих эмбрионов самкам-реципиен- конструкции при помощи микропипетки, закрепленной там. Позднее они были адаптированы для многих ви- в держателе микроманипулятора. На рис. 2, а видно, дов крупных сельскохозяйственных животных. В то же как сильно увеличился пронуклеус после инъекции – время достижения генной инженерии позволили созда- почти в два раза по сравнению с интактным. Потом эмвать генные конструкции, состоящие из рекомбинант- брионы пересаживают самке-реципиенту, многие из них ной ДНК определенного гена и различных управляю- нормально имплантируются и развиваются до рождещих последовательностей, регулирующих его работу. ния. Однако далеко не все животные, родившиеся из Так, Пальмитер с соавторами вводили в зиготы мыши инъецированных зигот, несут чужеродный ген. А те, ген гормона роста крысы, подсоединенный к металло- которые все-таки являются трансгенными, обычно тиониновому промотору. После пересадки эмбрионов оказываются мозаичными по введенному гену, то есть приемной матери родились трансгенные мышата нор- несут его не во всех тканях организма. Так что для мального размера. После окончания вскармливания получения трансгенных животных большое значение материнским молоком эти мышата получали корм с имеет молекулярно-генетический анализ родившегося СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 7, №4, БИОЛОГ ИЯ 1 3 Рис. 1. Этапы получения трансгенных животных методом инъекции генных конструкций в зиготу: 1 – получение зигот для инъецирования (используются индуцированная гормональными инъекциями суперовуляция или оплодотворение ооцитов в культуре in vitro); 2 – введение генной конструкции (микроинъекция в пронуклеус); 3 – пересадка эмбрионов самкам-реципиентам (реципиентами выбираются животные другой породы, отличающейся по окраске шерсти и другим породным признакам); 4 – животные, рожденные из инъецированных эмбрионов: только часть из них содержит трансген. Кроме того, эти животные, как правило, являются гетерозиготами (трансген содержится только в одной из гомологичных хромосом) и мозаиками (трансген содержится не во всех клетках и тканях животного); 5 – проведение молекулярно-генетического анализа для подтверждения присутствия вводимого гена в составе генома животного; 6 – отбор животных, продуцирующих трансгенные гаметы (скрещивание трансгенных животных с животными другой породы, отличающейся по окраске шерсти и другим породным признакам, и анализ их потомства). Селекция трансгенных гомозигот: скрещивание трансгенных животных для получения гомозиготных по введенному гену потомков; 7 – получение стада трансгенных животных; 8 – выделение лекарственного белка из молока и его очистка потомства. На этом этапе следует получить ответы на а три вопроса: первый – встроился ли трансген в геном, второй – несут ли трансген половые клетки, третий – экспрессируется ли чужеродный ген. Лучше всего, когда получен трансгенный самец, половые клетки которого содержат чужеродный ген, в этом случае трансген будет передан его детям. Самца можно скрестить со многими самками, в том числе и при помощи искусственного оплодотворения, и быстро получить многочисб ленное потомство (поколение F1). Животные F1 будут нести трансген во всех клетках организма, но только в одной из двух гомологичных хромосом, то есть они будут гетерозиготны по введенному гену. Для основания трансгенной линии надо получить поколение F2, скрещивая животных F1 между собой. Остается последний этап работы – анализ гомозигот из поколения F2 на активность трансгена. На этом этапе определяют, эксРис. 2. Методы трансфекции эмбрионов: микро- прессируется ли трансген и является ли эта экспрессия инъекция генетической конструкции в зиготу кролиспецифической, то есть идет ли она в тех органах и ткака (а), введение эмбриональных стволовых клеток в нях, где ее и предполагалось получить. Если конструкбластоцисту норки (б). Диаметр эмбрионов вместе ция несла промотор одного из белков молока и предс оболочками 140–150 мкм. Слева на фотографиях видны микроприсоски – они удерживают эмбрион полагалась экспрессия трансгена в клетках молочной на месте во время проведения процедуры (фотогражелезы, то встает еще один вопрос: выделяется ли трансфии любезно предоставлены Л.Е. Андреевой, рукогенный белок в молоко Когда наконец в результате долводителем Центра по созданию трансгенных животных Института молекулярной генетики РАН) гого и сложного пути получены животные, отвечающие СЕМЕНОВА М.Л. ЗАЧЕМ НУЖНЫ ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ БИОЛОГ ИЯ всем этим требованиям, можно считать, что работа по создания химерных животных. В настоящее время эту созданию линии трансгенных животных завершена. технологию чаще всего используют для получения Теперь их можно размножать, скрещивая между собой – трансгенных мышей, так как до недавнего времени сувсе их потомки наследуют чужеродный ген.





ществовали только линии ЭСК мыши. Однако за поВторая схема получения трансгенных животных следние несколько лет такие клеточные линии были (более новая), по-видимому, получит наибольшее рас- получены из бластоцист многих других млекопитаюпространение при создании крупных трансгенных жищих. Вот постоянно пополняющийся список этих вивотных – это схема с использованием эмбриональных дов: золотистый хомячок (1988), свинья (1990), овца стволовых клеток (ЭСК). В отличие от метода микро(1990), корова (1992), кролик (1993), крыса (1994), норинъекций в зиготу здесь еще на этапе работы с культука (1992), обезьяна (1995) и даже человек (1994). Так что рой ЭСК можно проанализировать как встраивание в ближайшие годы с использованием эмбриональных трансгена в геном клетки, так и количество встроивстволовых клеток могут быть созданы животные различшихся копий, а иногда и проверить экспрессию введенных видов. Эта схема получения трансгенных животные ного трансгена, что дает возможность выбрать линию выгодна еще и тем, что в этом случае используются не ЭСК с наилучшими свойствами. Часть этих клеток зиготы, как для микроинъекций, а бластоцисты, котоможно заморозить в жидком азоте и хранить многие горые легко вымываются из половых путей самок крупных ды для последующего создания трансгенных животных.

ЧТО ЖЕ ТАКОЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ Впервые линия эмбриональных стволовых клеток была получена из бластоцист мыши Эвансом, Кауфманом и Мартином в 1981 году. Эти клетки являются полипотентными, то есть в культуре они могут дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков. У 2 ЭСК не было обнаружено никаких хромосомных аббераций – они сохраняли нормальный генотип соматических клеток. В 1984 году было показано, что ЭСК, введенные в полость бластоцисты (рис. 2, б), дают начало любым органам и тканям химерных мышей, включая и линию половых клеток, и наследуются потомками химерного животного.

На рис. 3 показаны этапы получения трансгенных мышей при помощи ЭСК. Среди всех этих процедур одна из самых трудоемких – поддержание линии ЭСК в недифференцированном состоянии, пригодном для Рис. 3. Этапы получения трансгенных животных методом реконструкции эмбрионов с использованием эмбриональных стволовых клеток: 1 – получение культуры эмбриональных стволовых клеток (это клетки-потомки клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты). Бластоцисты культивируются на подложке их фибробластов, оседают на дно чашки Петри и распластываются. Клетки ВКМ несколько раз перевиваются, и некоторые из них дают начало линиям эмбриональных стволовых клеток; 2 – введение в эмбриональные стволовые клетки генетической конструкции (кроме управляющих последовательностей и вводимого гена конструкция должна нести ген, дающий возможность провести селекцию трансгенных клеток. Часто для этого используется бактериальный ген Neo – ген устойчивости к антибиотику неомицину, кодирующий неомицинтрансферазу. Немодифицированные клетки животных этого гена не имеют и в среде с неомицином погибают). Далее проводится молекулярно-генетический анализ колоний, происходящих из трансгенных клеток (анализируются встраивание введенного гена в геном клеток, количество копий и некоторые другие параметры); 3 – получение бластоцист для микроинъекции: их получают от животных другой линии, отличающейся по окраске шерсти; 4 – конструирование химерных эмбрионов: трансгенные эмбриональные стволовые клетки вводятся в полость бластоцисты; 5 – трансплантация химерных эмбрионов суррогатной матери; 6 – анализ родившихся животных. Часть их является химерами, то есть в состав их организма входят как клетки, происходящие из бластоцисты (на рисунке указаны белым цветом), так и клетки-потомки трансгенных эмбриональных стволовых клеток (на рисунке черные). Некоторые мыши вообще не содержат трансгенных клеток (на рисунке – полностью белое животное). Для скрещивания отбираются те мыши, у которых процент трансгенных клеток выше (на рисунке – почти полностью черные животные). Лучше, когда выбранное животное является самцом – от него быстро можно получить большое количество потомков; 7 – скрещивание химерных самцов с самками альбиносной линии и анализ их потомства.

Так выявляются химерные животные, продуцирующие трансгенные гаметы; 8 – скрещивание мышей поколения F1 животных для получения гомозиготных по введенному гену потомков СОРОСОВСКИЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЖУРНАЛ, ТОМ 7, №4, БИОЛОГ ИЯ видов млекопитающих нехирургическим путем. Для транслокацией очень низок, но только они выживают в всех видов сельскохозяйственных животных разрабо- селективной среде, содержащей антибиотик неомицин.

таны методики длительного хранения эмбрионов на ДЛЯ ЧЕГО ИСПОЛЬЗУЮТ стадии бластоцисты в жидком азоте и методы нехирурТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ СЕГОДНЯ гической трансплантации их суррогатным матерям.

Pages:     || 2 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.