WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

   Добро пожаловать!


Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ Учебное пособие по специальностям 011000 – Химия, 040500 – Фармация, 011600 - Биология Воронеж 2004 2 Утверждено научно-методическим советом химического факультета от 20.12.2003, протокол №7.

Авторы: Котова Д.Л., Крысанова Т.А., Елисеева Т.В.

Учебное пособие подготовлено на кафедре аналитической химии химического факультета Воронежского государственного университета.

Рекомендуется для студентов 3 курса химического факультета, 1 и 2 курсов биологического и фармацевтического факультета, а также для дипломников, аспирантов, научных сотрудников, занимающихся выделением, разделением и определением аминокислот в водных растворах.

3 Содержание 1. Метод электронной спектроскопии 4 1.1. Введение в электронную спектроскопию. Спектры 4 поглощения 1.2. Основной закон светопоглощения Бугера – Ламберта – 6 Бера и причины отклонения от закона 2. Аналитические возможности спектрофотометрии при 9 исследовании растворов органических веществ 3. Анализ современных представлений о структурных 20 особенностях и природе взаимодействий в системе вода – аминокислота 3.1. Физико-химические характеристики аминокислот 20 3.2. Особенности структурных взаимодействий 27 в системе вода – аминокислота 4. Методы определения, выделения и разделения 30 аминокислот 5. Особенности спектрофотометрического определения 33 аминокислот в водном растворе 6. Выбор оптимальных условий спектрофотометрического 36 определения аминокислот 7. Литература 52 4 1. МЕТОД ЭЛЕКТРОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ 1.1. Введение в электронную спектроскопию. Спектры поглощения Частицы можно охарактеризовать по их способности поглощать или испускать излучение. Эта характеристика оказалась настолько важной, что в настоящее время существует раздел химии, называемый спектральный (спектрохимический) анализ. В основепоследнего лежит изучение спектра электромагнитного излучения, которое поглощается или излучается анализируемым веществом. Спектральные методы анализа классифицируются по характеру взаимодействия электромагнитного излучения с веществом (эмиссионные и абсорбционные). Абсорбционный анализ, в свою очередь, классифицируется, с одной стороны, по типу используемой области электромагнитного излучения (спектрофотометрия в видимой и УФ - областях, ИК-спектроскопия), с другой – по типу поглощающих частиц (атомы и молекулы).

Электромагнитное излучение представляет собой вид энергии, которая распространяется с огромной скоростью. Эта энергия существует в многочисленных формах, из которых наиболее легко распознаются свет и тепловое излучение. Менее очевидно проявление рентгеновского, ультрафиолетового, микроволнового и радиоизлучения.

Электромагнитным спектром является графическая зависимость некоторого измеряемого свойства излучения как функция частоты излучения. Из спектра можно получить два вида важной информации. Вопервых, по виду спектра можно качественно идентифицировать химические частицы. Во-вторых, по значению измеряемого свойства излучения можно определить количество присутствующих химических частиц. Электромагнитный спектр охватывает огромную область длин волн или энергий. Основные области спектра, используемые в спектральном анализе [1]:

Интервал длин волн Участок спектра 10-4 …0,1 нм, или 10-13 …10-10 м - излучение 10-2 …10 нм, или 10-11 – 10-8 м Рентгеновское излучение 10 …400 нм, или 10-8 …4 ·10-7 м Ультрафиолетовое излучение 400 …760 нм, или 4 · 10-7 …7,6 · 10-7 м Видимый свет 760 …106 нм, или 7,6 · 10-7 …10-3 м Инфракрасное излучение 10-3 …1 м Микроволны или СВЧ > 1 м Радиоволны (1 нм = 10-9 м) Фотон имеет определённую энергию и может вызывать переходы между квантовыми энергетическими состояниями в атомах, молекулах и других химических частицах. Чтобы вызвать такой переход, энергия фотона должна быть равна разности между энергетическими состояниями, соответствующими данному переходу. Энергетические состояния разных химических частиц отличаются, поэтому можно ожидать, что изменения энергии, связанные с переходами, также будут различны. Это значит, что спектр каждого вещества будет строго индивидуальным, и его можно использовать для идентификации этого вещества. Фактически спектр отражает схему возможных переходов, которые имеют место между различными энергетическими состояниями химической частицы. Если измеряемый параметр в спектре может быть отнесён к числу переходов, спектр может быть использован для определения концентрации присутствующих частиц. Разделение спектра электромагнитного излучения на области обусловлено не только тем, что каждой области присущ свой тип перехода, но и различием спектральной аппаратуры, необходимой для проведения соответствующих измерений в каждой области. По этой причинеспектральный анализ чрезвычайно разнообразен и включает несколько методов. Молекулярно-абсорбционные методы основаны на измерении уменьшения интенсивности электромагнитного излучения, прошедшего через анализируемое вещество. В зависимости от области оптического диапазона, способа измерения и ширины полосы измеряемого излучения различают следующие молекулярноабсорбционные методы: колориметрию – сравнение окраски анализируемого и стандартного раствора вещества визуальным способом;

фотометрию – измерение интенсивности светового потока, прошедшего через раствор вещества фотоэлектрическим способом; спектрофотометрию – измерение интенсивности монохроматического (определённой длины волны) светового потока, прошедшего через раствор вещества фотоэлектрическим способом. В зависимости от длины волны различают:



спектрофотометрию в ультрафиолетовой (УФ), видимой (В) и инфракрасной (ИК) области спектра.

Возникновение спектров поглощения в УФ и видимой области спектра объясняется способностью электронов на некоторых орбиталях поглощать кванты света и переходить на более высокие энергетические уровни. Поэтому часто такие спектры называют электронными. В ИКобласти кванты света поглощают отдельные функциональные группы, атомы которых при этом изменяют уровни своих колебательных и вращательных движений. ИК-спектры поэтому называют молекулярными (колебательными и вращательными) [2,3].

Свет поглощается раствором избирательно: при некоторых длинах волн светопоглощение происходит интенсивно, а при некоторых свет не поглощается. Интенсивно поглощаются кванты света, энергия которых (h) равна энергии возбуждения частицы и вероятность их поглощения больше нуля. Молярный коэффициент поглощения при этих частотах (или длинах волн) достигает больших значений. Распределение по частотам (или по длинам волн) значений молярного коэффициента поглощения называется спектром поглощения. Обычно спектр поглощения выражают в виде графической зависимости абсорбционности (А) или молярного коэффициента поглощения () от частоты () или длины волны () падающего света.

Наибольший интерес представляют следующие характеристики спектра: число максимумов (или полос поглощения) и их положение по шкале длин волн (или частот); высота максимума; форма полос поглощения.

Cпектральные линии имеют различную форму и разную (и обязательно конечную) ширину, что обусловлено свойствами самой поглощающей системы и внешними условиями (температура, давление), а также размером входной щели регистрирующего спектрометра. Шириной щели называют ширину её контура при значении ординаты, равной max/2.

Причиной уширения линии является то, что энергетические уровни атомных и молекулярных систем всегда размыты. Существует три причины неопределённости положения энергетических уровней:

1) столкновительное (ударное) или лоренцевское уширение.

Столкновение атомов и молекул вызывают деформацию электронных оболочек и возмущают энергетические уровни, по крайней мере валентных электронов. Это уширение особенно, характерно для видимой и УФ области спектра;

2) доплеровское уширение. В результате теплового движения излучающих частиц все спектральные линии испытывают доплеровское уширение;

3) естественное уширение. Даже если бы удалось абсолютно изолировать атомы и молекулы при очень низких температурах, энергетические уровни всё равно не имели бы нулевой ширины.

Ширина уровней и ширина линии “покоящейся” атомной или молекулярной системы называетсяестественной шириной.

Таким образом, чем выше молярный коэффициент поглощения и меньше ширина полосы, тем более ценными химико-аналитическими свойствами обладает соединение, так как эти характеристики определяют предел обнаружения и селективность [3].

1.2. Основной закон светопоглощения Бугера – Ламберта - Бера и причины отклонения от закона Основа спектрофотометрии – закон Бугера – Ламберта - Бера – закон ослабления монохроматического света при поглощении его слоем вещества может быть выражен в форме:

I = I0 10 - c l, (1) или I /I0 = 10 - c l, (2) A = c l, (3) где I0, I – интенсивности света до и после его прохождения через поглощающую среду (эти интенсивности сравнивают для учета потерь света на отражение и рассеяние);

- коэффициент поглощения света, зависящий от длины волны и природы вещества; при с = 1 моль/л и l = 1 см он называется молярным коэффициентом поглощения (единицы измерения – л/мольсм);

c – концентрация вещества, поглощающего свет (моль/л);

l - толщина светопоглощающего слоя (см);

А – абсорбционность (А= - lg I /I0).

Атом, ион или молекула, поглощая квант света, переходит в более высокое энергетическое состояние. Обычно это – переход с основного (невозбужденного) уровня на первый возбужденный энергетический уровень. Вследствие поглощения излучения при прохождении его через слой светопоглощающего вещества интенсивность излучения уменьшается и тем больше, чем выше концентрация светопоглощающего вещества.

В соответствии с уравнением (3) зависимость оптической плотности от концентрации отображается прямой линией, выходящей из начала координат (рис.1).

A C Рис.1. Зависимость абсорбционности от концентрации поглощающего свет вещества в растворе при соблюдении закона Бугера – Ламберта - Бера (1), положительных (2), и отрицательных (3) отклонениях от него Линейная зависимость соблюдается не всегда. Поэтому, на практике закон Бугера-Ламберта-Бера необходимо применять со следующими ограничениями :

1) Закон справедлив длясвета строго определенной длины волны;

2) Температура при измерениях должна быть постоянной;

3) Коэффициент поглощения света () зависит от показателя преломления среды (для того, чтобы показатели преломления исследуемого раствора и чистого растворителя оставались одинаковыми, измерения следует проводить в области мало концентрированных растворов);

4) Закон выполняется для частиц одной природы (измерение следует вести в таком интервалеконцентраций, где заведомо неможет быть реакций диссоциации, ассоциации, флуоресценции и химических реакций с растворителем);





5) Пучок света должен быть параллельным.

Если исследования проводят с гомогенной изотропной средой (толщина светопоглощающего слоя (l) = const), то зависимость абсорбционности от концентрации отображается прямой линией. Значение тангенса угла наклона этой прямой равно коэффициенту поглощения света.

Отклонения от прямой возможны из-за химических реакций, приводящих к сдвигу химического равновесия, который, в свою очередь, вызывает изменение концентрации поглощающей формы вещества. К причинам отклонения прямой от линейности относится рассеяние поглощающего вещества в объеме объекта, которое наблюдается при спектрофотометрии биологических объектов со сложной пространственной структурой. Так же отклонения могут появляться из-за приборной ошибки, вызываемой нелинейностью зависимости тока фотоэлементов от интенсивности потока света при малых (менее 0,1) и больших (1,5) значениях абсорбционности раствора (эта опасность реальна в дальней ультрафиолетовой области 190 - 220 нм, где рассеянный свет вызывает сдвиг максимумов поглощения) [3].

Увеличение ширины щели спектрального прибора приводит к падению оптической плотности и показателя светопоглощения в максимумах спектральных линий и их увеличению в минимумах. Эти изменения мало заметны для веществ с широкими спектральными полосами. Необходимо, чтобы ширина щели была меньше полуширины спектральной полосы.

Если нельзя избежать отклонений от закона Бугера-Ламберта-Бера, изменяя условия анализа (аналитическую длину волны, растворитель, интервал концентраций), то выбирают область, где зависимость абсорбционности от концентрации линейна приближенно.

На практике следует помнить об оптимальных условиях спектрофотометрического определения:

1) при определении в растворе одного светопоглощающего вещества выбирают аналитическую длину волны на максимуме полосы поглощения.

Если в спектре несколько полос, выбор останавливают на более интенсивной полосе, что обуславливает высокую чувствительность определения. Более предпочтительны плоские максимумы, так как погрешность в установлении длины волны здесьминимальна. Необходимо учитывать, что чем уже полоса поглощения, тем меньше ее симметрия;

чем в более коротковолновой области она расположена, тем больше ее немонохроматичность.

2) оптимальная абсорбционность составляет примерно 0,6...0,7 или несколько выше. Наибольшими погрешностями характеризуется абсорбционность растворов менее 0,05 и более 1,5;

3) в работе необходимо использовать кюветы с толщиной слоя меньше чем 5 см, что понизит потери на рассеяние света;

4) превращение определяемого компонента в окрашенное соединение определяет точность спектрофотометрического анализа. Такие соединения получают в результате реакций окисления - восстановления и комплексообразования. Если окислительно-восстановительные реакции протекают практически до конца, то реакции комплексообразования осложняют процесс спектрофотометрического определения вещества.

Поэтому, используя эти реакции, нужно рассчитывать, при каких значениях pH и концентрации реагента будет достигнута необходимая полнота реакции.

2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ CПЕКТРОФОТОМЕТРИИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ РАСТВОРОВ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Количественный и качественный анализ - традиционные области применения молекулярной спектроскопии. Спектрофотометрия в видимой и УФ – области спектра является одним из самых распространенных методов исследования органических соединений. Достоинствами метода являются быстрота, незначительное количество необходимого вещества и его сохранение в процессе анализа.

Качественный анализ вещества предполагает, во-первых, молекулярный анализ - обнаружение в веществе определенных молекул, во-вторых, структурный анализ – обнаружение отдельных структурных фрагментов и определение их взаимного расположения.

Положение и интенсивность полос поглощения вещества определяется содержащимися в нем хромофорными группами с сопряженными кратными связями. Поэтому идентификацию исследуемого вещества целесообразно проводить только при наличии в нем хромофорных групп. Так как интенсивность полос чувствительна к растворителю, идентифицировать вещество по электронному спектру можно только в том же растворителе, в котором получен сравниваемый спектр. Полосы в электронных спектрах различаются по интенсивности на несколько порядков, поэтому необходимо иметь в виду возможность присутствия светопоглощающих примесей.

Спектр исследуемого соединения сравнивают с приведенным в литературе спектром данного соединения или с полученным ранее спектром известного образца. О тождественности этих соединений может свидетельствовать наличие всей совокупности полос поглощения в обоих спектрах с совпадающими с точностью до 1 нм положениями максимумов.

Увеличение интенсивности отдельных максимумов может быть вызвано присутствием в растворе вещества, имеющего более протяженную цепь сопряженных связей. Присутствие в веществе примесей, не имеющих кратных связей, проявляется в уменьшении показателей поглощения вещества в исследуемом спектре. Этот же эффект наблюдается, если в молекуле имеется большая по объему и молекулярной массе группа атомов, не имеющих кратных связей и не влияющая на электронные свойства других групп [4].

Следовательно, спектрофотометрия позволяет проводить идентификацию вещества по спектру в УФ - и видимой области спектра при наличии в нем сопряженных кратных связей и рассчитывать молекулярную массу поглощающего вещества.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |










© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.